cxcl12促进人胃癌ags细胞体外侵袭及其机制研究

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1、CXCL12促进人胃癌AGS细胞体外侵袭及其机制研究【摘要】目的研究趋化因子CXCL12对人胃癌AGS细胞侵袭性的影响。方法在体外用不同浓度CXCL12处理AGS细胞后，应用Transwell侵袭实验、RTPCR、明胶酶谱分析法、ELISA法，观察CXCL12对肿瘤体外侵袭能力及金属基质蛋白酶MMP9活性和VEGF表达的影响。结果CXCL12作用后，人胃癌AGS细胞侵袭能力明显增强，并具一定的量效关系；金属基质蛋白酶MMP9活性呈剂量依赖性增强，VEGF的分泌增加。结论CXCL12在体外可增加人胃癌AGS细胞的体外侵袭性。【关键词】趋化因子；CXCL12；胃癌；胃黏膜上皮细

2、胞；金属基质蛋白酶9ABSTRACT：ObjectiveTostudytheeffectsofCXCL12ontheinvasionofthehumangastriccarcinomacell(AGScell).MethodsAGScellswerepretreatedwithdifferentconcentrationsofCXCL12invitro,andcellmigrationassay,RTPCR,zymographyandELISAwereusedtoobservedtheeffectsofCXCL12onmotility,invasionandMMP9activ

3、ityandmRNAexpressionofAGScells.ResultsCXCL12couldincreaseinvasionabilityofAGScellinvitro.TheactivityofMMP9wasincreasedinadose11dependentmanner.ThemRNAexpressionofMMP9ofpretreatedAGScellswasupregulated.ConclusionCXCL12couldincreaseinvasionabilityofhumangastriccarcinomacellsinvitro.KEYWORDS

4、：Chemokine;CXCL12;Gastriccancer;AGScells；MMP9肿瘤的侵袭是肿瘤转移的重要环节，是肿瘤细胞粘附、酶降解基质、移动、基质内增殖等一系列过程的表现[1]。本研究体外观察了趋化因子CXCL12对肿瘤体外基质金属蛋白酶MMP9活性以及VEGF表达的影响，以探讨CXCL12促进胃癌细胞侵袭转移的作用机制。1材料和方法1．1实验材料CXCL12购自美国Sigma公司；胰蛋白酶和DMEM培养基(高糖)购自Gibco公司(USA)；胎牛血清购自杭州四季青公司(CHINA)；TrizolReagent购自TaKaRa公司(JAPAN)；MMLV逆转录

5、酶、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)、dNTP混合物购自Promega公司(USA)；引物序列由上海Invitrogen公司(USA)合成；Transwell侵袭小室购自Costar公司(USA)；人工基质胶(Matrigel)购自BD公司(SPAIN)。111．2实验方法1．2．1细胞培养人胃癌AGS细胞购自武汉大学细胞典藏中心(CTCC)。AGS细胞贴壁培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基，37°C、5%CO2饱和湿度条件下培养。取对数生长期细胞进行实验。按如下分组进行实验：空白对照组、50ng/mlCXCL12组和100

6、ng/mlCXCL12组，每组设置3个平行孔。1．2．2Transwell侵袭小室检测细胞侵袭能力的变化侵袭能力的测定采用Transwell侵袭小室：Matrigel胶(30μg/孔)包被聚碳酸酯膜(8μm孔径)内表面，以此膜分隔上、下小室。无血清DMEM调整细胞浓度为1×106/ml，在上室中加入100μl细胞悬液，在下室中加入600μl含不同浓度CXCL12的无血清培养液，然后在37°C的培养箱中孵育48h，取出滤膜，用4%的多聚甲醛固定，棉签擦去滤膜上未贴壁的细胞，甲醛固定5min，HE染色。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力

7、。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。111．2．3RNA提取和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)RNA提取参照RNATrizol提取试剂盒的操作说明书进行。提取的RNA纯度由A260/A280比值和1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取1μgRNA，以OligodT为引物逆转录成cDNA。反应体系(20μl)：5×MMLVbuffer4μl，dNTP10mmol，RNase20U，MMLV100U，OligodT20pmol，RNA1μg。逆转录反