ebf3与egfp融合蛋白表达载体的构建及其在hepg2中的表达

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1、EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达：毛丽萍王惠民,王跃国,汪晓莺【摘要】目的:构建早期B细胞因子3（EBF3）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3,使EBF3EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达。方法:采用RTPCR技术,从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因,构建EBF3与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3,用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3导入HepG2,使EBF3EGFP融合蛋白得到表达。结果:经转化

2、细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实,EBF3基因已正确插入pEGFPN1中EGFP基因的上游,获得融合基因表达载体pEGFP/EBF3。将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞24h后,在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3EGFP融合蛋白主要表达于核内,转染pEGFP/EBF3和pEGFPN1后48h的转染效率分别为52%和59%。r）为87000的EBF3EGFP融合蛋白,转染pEGFP/EBF3后48h和72h,S期细胞比例均明显高于pEGFPN1转染细胞组和未转染细胞组,表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G

3、1期向G2期发展,从而促进细胞增殖。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP/EBF3,并在HepG2细胞中进行了表达,为进一步研究EBF3的功能提供实验基础。【关键词】早期B细胞因子3;融合蛋白;增强型绿色荧光蛋白;HepG2细胞［Abstract］AIM:ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorforearlyhumanBcellfactor3(EBF3)fusedplifiedfromRNAisolatedfromtheplacentaltissuebyRTPCR.Thenitedb

4、yDNAsequencing,enzymaticdigestionandPCRidentification.24hafterthefusionproteinEBF3EGFPainlyinthecellularnucleusundertheinvertedfluorescencemicroscope.BothpEGFP/EBF3andpEGFPN1anHepG2cells.24hafterthetransfection,theproportionoftransfectionedthattheEBF3EGFPfusionprot

5、einsofMr87000icandnuclearproteinofHepG2transfectedG1phasetoG2phasebyincreasingthenumberofcells.CONCLUSION:TheconstructionofpEGFP/EBF3eukaryoticexpressionvectorandtheexpressionofEBF3EGFPfusionproteininHepG2cellslayafoundationforfurtherstudyoftherelationshipbetorcells.

6、［KeyRNA全长为4361bp,基因定位于染色体10q26.3。Zardo等［2］研究发现EBF3mRNA广泛表达于心脏、胎盘、肝脏、骨骼肌等组织,在大多数）分析转染细胞周期的变化。1材料和方法1.1材料人肝癌细胞株（HepG2）由浙江大学医学院附属第一医院陈瑜惠赠。真核表达载体pEGFPN1由本室保存;限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ、dNTPs购自Promega公司;T4DNA连接酶购自NeineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司;PhusionTMHotStart高保真DNA聚合酶购自Finnzymes公

7、司;胶回收试剂盒购自上海华舜公司;DNAmarkerDL2000购自TaKaRa公司;RPMI1640培养液购自南京凯基公司;胎牛血清购自Gibco公司;倒置荧光显微镜购自Leica公司;流式细胞仪购自BDFACSCalibur公司。细胞质与细胞核蛋白提取试剂盒、cocktail酶抑制剂购自Pierce公司;001005463）基因5′端序列并在ATG前加入Kozak序列（GCCACC）以提高翻译起始效率,并在5′引入HindⅢ酶切位点和保护碱基,设计前向引物为5′CCAAAAGCTTGCCACCATGTTTGGGATTCAGG

8、AG3′。逆向引物设计时,将人EBF3的终止密码子删除并使其阅读框与下游的EGFP基因一致,在5′加入BamHⅠ酶切位点和保护碱基,其序列为5′CGTCGGATCCCGCATTGGCGGGACTACCAGC3′。引物由上海生工公司合成。提取人