人颗粒溶素与egfp基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞raw264.7中的表达

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1、人颗粒溶素与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达作者：伊正君，朱道银，李俊明，何永林，杨健，李娜【关键词】巨噬细胞ConstructionofafusiongeneexpressionvectorcontaininghumangranulysinandgreenfluorescentprotEingeneanditsexpressioninmurinemacrophageRA:ToclonethehumangranulysinfromactivatedcytotoxicTlymphocytes(CTL),constru

2、ctaneukaryoticexpressionvectorcontainingthefusiongeneofgranulysin(GLS)andgreenfluorescentprotEInreporterandobserveitsexpressioninmurinemacrophageRAETHODS:ThecodingsequenceofthegranulysinplifiedfromthetotalRNAofhumanCTLactivatedbyallogenicantigenafterreversetranscriptionbyNestedP

3、CR,insertedintopEGFPC1plasmidandthentransfectedRAC）总RNA中扩增出GLS的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白报告基因融合的真核表达载体，转染到鼠巨噬细胞株RAC)分离液及植物血凝素（PHA）购自第三军医大学试剂服务中心；质粒小量抽提试剂盒、PCR产物及凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司；限制性核酸内切酶BsPEI，BamHI购自NEB公司；小量组织/细胞总RNA抽提试剂盒、正常熔点琼脂糖（NMA）,高保真ProbestTaq酶、T4DNA连接酶、逆转录试剂盒（Ver.3.0）、DNAMarkerDL

4、2000等均购自大连宝生物公司；GenePorter2真核转染试剂为美国GTS公司产品；山羊抗人GLS抗体购自基因公司；即用型免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德；RPMI1640培养液购自Gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品.　　1.2方法　　根据GeneBank中人GLS的cDNA序列，共设计合成了4条引物：PG1:5′GCGCTAGCGTATCTGTGGTAAACCCAGTG3′;PG2:5′GCGGTACCCTTGCTTGACACTTTATTCTCG3′;PGE1:5′GCTCCGGAAAGCTTCATATGAACCCAGGTCTGGTCT

5、TCTC3′;PGE2:5′TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCAGAGGGGACCTGTAGAAG3′;全部由大连宝生物公司合成.由于表达产物定位于巨噬细胞胞质内表达，因此在PGE1引物设计中去除了GLS的分泌肽编码序列.首先用PHA活化外周血单个核细胞，然后用同种异型抗原诱导、刺激其中的CTL细胞和NK细胞活化，从而启动GLS基因的转录.方法是，无菌采集2份健康人静脉血各6mL，肝素抗凝.1500r/min离心10min，分别吸出上层血浆及白细胞层，然后用PBS缓冲液1∶1稀释白细胞，再按PBMC分离液说明，常规分离外周血单个核细胞.取其中

6、一份PBMC样本洗涤2次后以含100mL/L自体血浆的完全RPMI1640培养液重悬，调节细胞浓度为2×106/L，加入PHA使其终浓度为200mg/L，置37℃，50mL/LCO2培养箱中，培养24h后加入另一份样本（此样本PBMC经灭活处理后以含100mL/L灭活小牛血清的完全RPMI1640培养液重悬）共同培养48h后收获细胞.　　1.2.1GLScDNA的扩增、克隆与测序抽提细胞总RNA，逆转录后调适相应的缓冲液，用高保真ProbestTaq酶取代试剂盒自带的HSTaq,用引物PG1，PG2进行PCR扩增25个循环，获得包含目标序列在内的GLS

7、cDNA全长片段.然后取产物2μL为模板，以引物PGE1与PGE2进行套式扩增，反应条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸8min.10g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测.纯化后以BsPEI，BamHI双酶切、回收，与同样处理的pEGFPC1载体大片段在16℃连接1h，转化大肠杆菌TOP10，涂布于含30mg/L卡那霉素LB平板上培养，次日挑取卡那霉素抗性单菌落，进行PCR鉴定，阳性克隆置3mL含30mg/L卡那霉素LB培养基中振摇增菌，小量抽提质粒，用BsPEI与BamHI进行双酶切鉴定，送上海博亚公司测序

8、.　　1.2.2细胞转染及表达产物的检测RAI1640培养基中，以24孔板置37℃，50mL/