i-3合蛋白表达载体与l1融非融合蛋白表达载体的构建与比较

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1、≯240一?zUPharma吲m曙1997年第l8眷第5IL-13融合蛋白表达载体与非融合蛋白表达载体的构建与比较王文，孙j田志刚王郡甫刘杰张建华刘钟王寞山东省医学科学院山东肿宿生物治疗研究中心(济南250D62)．尺摘要采用RT-IXCR技术直接从擞活的幢康人外周血单十校细胞中扩增得到hIL-13的基／片殷，通过DINA重组技术分别将其插入到古有PlPL启动子的高敢表选载体pBV==o及古tac启动子，lacl阻遏蛋白基因及凝血酶识别位点的融台蛋白表迭载体pGⅨ一41"-2中，成功地构建了hⅡ，13的原校非融合蛋白表达菌株hⅡ，l3一pBV~0／DHs．及融合蛋白表达菌株ⅫL．13-pGE

2、x一{T一2／TO-．分别经42"C热诱导及异丙基硫代半乳糖昔(IPTG)化学诱导后，SI3S-PAGE结果表明IL-13仅以GST融合蛋白的形式在丑枷中获得了表达，表达量约占菌体蛋白总量的10％～30。Ⅱ广J3的蛋白单体在原校细胞中表达量很低。关麓调ILl31融合蛋白l非融合蛋白j表达载体—1一～＼一1L-13是1993年才正式命名的一种新的、I．I．I质粒和菌株．oTG，本室保存多功能的细胞因子[I】。初步研究表明IL—I3是菌株{融合蛋白表达载体pGEX-4T一2，Pbama．一个重要的新型B淋巴细胞生长刺激因子及da公司，其N端所具有的原核多肽GST的遣血生长因子0】，它对于单核巨噬

3、细胞、大颗分子量为26kD；非融合蛋白表达载体pBv粒淋巴细胞、中性粒细胞、内皮细胞等多种细及宿主菌．oDHs，中国预防医学科学院胞也具有显著的调节作用在改善机体免疫病毒学研究所张智清教授惠赠。功能、控制炎症反应的发生及在机体lgE介1．1．2酶及实验试剂各种限制性内切酶导的I型超敏反应中占有重要的地位[。本及PCR成套试剂，华美生物工程公司}AMV实验室在成功地构建了IL广2、IL-6原核表达逆转录酶及T噬菌体DNA连接薛，Prome~a载体的基础上】，于1993年开展了IL-13非公司}异丙基巯代半乳糖苷(IFI'G)，Sigma公融合蛋白表达载体的构建工作，将hIL-13基司。因片段插

4、入到表达载体pBVm的合适位置，I．2方法但却未出现IL-I3的明显表达分析各种可能I．2．I引物的设计与合成参照已知的的原因，并借鉴国外的经验，我们又重新进hlL-13的基因序列，分析其最佳转译起始行了l【广13融合表达载体的构建工作，并使区，并考虑了插入非融合蛋白及融合蛋白表IL-13在原核细胞中最终表达成功。达载体的酶切位点，设计出特异性的lL_13的引物PI和Pt在P，中，上游引物；I材料与方法5CGGAA'rTCATGCCTCCCTCTACA~"ccrc1．I材料CAG3，下游引物l5，CAGGATCCTTAG'rT1上冉第二医科大学上冉市免疫学研究所收{膏日期1996-99-12

5、第1孜謦回El期1997-91-94第2孜謦回El期1997．99．1l一224—国生化药物杂志c啪eseJau!!!塑!!!至璺鲞墨GAACCGTCCCTCGCG3，。上游引物中含有续诱导7～10h后，分别离心收集菌体，傲EcoRI的酶切位点、ATG起始密码及hlL一13sDs—PAGE(参照文献[9])检测IL广l3在两种全长序列N端第2l位氨基酸开始的部分编不同培养体系中的诱导表达情况。码序列；下游引物中含有BamHI的酶切位PuA(10g，咖)＼点，TTA终止密码及hlL一3末端部分氨基酸＼编码序列的互补序列。在P：中，上游引物：“D+／节【5CAGGATCCCCTC~CTCTACA

6、GCCCTCAG—TPA(10nB／m1)TotalRNAA洲RTG3一，下游引物：5rCGGAATTC'I~AGTTG—+~DNAAACCGTC~CTCGCG3r。在Pj的上游引物中，设计插入了BamHI的酶切位点，而在下游引物中插入了EeoRI的酶切位点。引物P】和P分别由山东省医学科学院基础研究所生物技术中心及北京大学生命科学院合成。1．2．2细胞总RNA的提取采用single—step法进行。Campeteat且“TG-／DHstt1．2．3RT—PCR参照文献[8]。为防止ltRNA的降解，RNA提取后马上进行逆转录反scr∞randldent]fi~flonofPmitivea0

7、应及PCR扩增。PCR各反应参数为先94oC变8LDNASeq~cncing性5rain，然后加入Taq酶和液体石蜡，在特固lIL'I3表达载体的柯建异I物P和Pt的指导下，随后进行30个循环，每个循环都包括94℃变性1min，55℃退2结果火1删n和72℃延伸2min，最后于72℃延伸72-lRT—PCR扩增hIL-13基因片段mln。i琼脂糖凝胶电泳观察RT—PCR扩增选用激活的健康人外周血单个核细胞结果