tlr9在胃癌细胞上的表达及其作用的实验研究

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1、TLR9在胃癌细胞上的表达及其作用的实验研究【关键词】CpGODN;MTT;胃癌细胞;TLR9　肿瘤作为临床常见的恶性病，严重威胁着人类的生命。恶性肿瘤死亡第1位的是肺癌，其次为肝癌和胃癌[1]，且逐年递增。Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)是一类新近发现的能识别微生物，特别是细菌和病毒的模式识别受体(patternrecognitionreceptor,PRR)，介导固有免疫反应并桥接或触发适应性免疫。近年研究发现，TLRs可在各种肿瘤细胞中表达，参与肿瘤免疫监视，并对肿瘤的生长发挥不同的作用[2]。本研究以胃癌细胞系MGC803细胞为研究对象

2、，通过观察MGC803细胞上TLR9的表达及TLR9激动剂寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)对MGC803细胞生长的影响，探讨TLR9在胃癌发生发展中的可能作用。　　1材料和方法　　1.1材料　　RPMI1640培养基，为GBICO公司产品;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Amresco公司;新生牛血清为民海生物公司产品;TLR9引物及其激动剂CpGODN1826由北京赛百盛生物基因技术有限公司合成。逆转录试剂盒购于Fermentas公司;SYBRGreenPCRMasterMix试剂盒购自美国应用生物公司。MGC803细胞为本室保存，TRIZOL试剂为Invitrogen原装产品。

3、　　1.2方法　　1.2.1合成TLR9引物及其激动剂CpG-ODN1816　　TLR9引物序列为：5′-GGACACTCCCAGCTCTGAAG-3′(上游引物)，5′-TTGGCTGTGGATGTTGTTGT-3′(下游引物);内参为β-actin(上游引物：5′-TAGAGATTGGAGGTTGTTCCT-3′;下游引物：5′-TCCACCAACTAAGAACGGCC-3′)。TLR9激动剂CpG-ODN1816序列如下：5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'，全程硫代修饰。总RNA采用TRIZOL试剂提取，以其为模板严格按照反转录试剂盒说明书要求逆转录

4、合成cDNA，然后采用25μL反应体系，按以下条件对TLR9及内参照β-actin同时进行PCR扩增：94℃预变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸5min。反应完毕，取10μLPCR产物在1.5%琼脂凝胶中进行电泳。电泳完毕后，在凝胶分析仪下进行观察并同时成像。　　1.2.2MGC803细胞的培养　　按常规方法用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度的孵箱中培养。取处于对数生长期且细胞活性大于98%的细胞进行实验。　　1.2.3MTT法检测细胞增殖活性　　调整细胞浓度为2×107·L-1。实验

5、分为2组：阴性对照组和加药组,每组设3个平行孔。96孔培养板中每孔加入90μL细胞、10μLCpG-ODN(10μg·mL-1)或培养液，分别作用24、48h和72h后，终止培养。每孔加入MTT(终浓度为5μg·mL-1)10μL，37℃孵育3h后，选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔A值。　　1.2.4FCM检测细胞凋亡　　收集105个经10μg·mL-1CpGODN作用24h后的细胞，离心弃去上清，用PBS洗涤2遍后，重悬细胞，加入5μLAnnexinV室温避光孵育10min后，用PBS洗1遍，加入10μL碘化丙锭(PI)后上流式细胞仪检测。　　1.3统计学方法

6、　　全部数据采用SPSS11.0处理，计量资料的组间比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1TLR9在MGC803细胞的表达　　经RT-PCR法测定MGC803细胞有TLR9mRNA的表达(见图1)。1.Marker;2.TLR9;3.β-actin图1RT-PCR扩增产物电泳图　　2.2CpGODN对MGC803细胞生长的抑制作用　　10μg·mL-1CpGODN作用于MGC803细胞24、48h和72h后，用MTT法检测细胞增殖活性，结果见表1。表1TLR9激动剂CpGODN对MGC803细胞增殖的影响　　2.3CpGODN作用MGC803

7、细胞后细胞凋亡的测定　　10μg·mL-1CpGODN作用于MGC803细胞24h后，用流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡(结果如图2Q4区所示)，CpGODN可促进MGC803细胞的早期凋亡。(注：Q1区，细胞收集过程中出现的损伤细胞;Q2区，凋亡中晚期细胞;Q3区，活细胞;Q4区为早期凋亡细胞)图2激动剂作用24h后的细胞凋亡(注：Q1区，细胞收集过程中出现的损伤细胞;Q2区，凋亡中晚期细胞;Q3区，活细胞;Q4区为早期凋亡细胞)图3细胞双染色对照组　　研究发现TLR9在肿瘤上的表达可为肿瘤的化疗、免