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1、TLR9表达与胃癌临床病理特征关系的初步研究作者：马亚军1,张艳丽1,崔柳1,李秀萍2作者单位：1•宁夏医科大学；2.宁夏医科大学总医院【摘要】冃的观察TLR9在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系。方法运用Western-blot方法测定胃癌细胞系MGC8O3TLR9的表达;用不同浓度的TLR9激动剂CpG0DN(2、5、10Mg?mL-l)分别作用于胃癌细胞系MGC803不同吋间(24、48、72h)后，用四甲基偶氮醴盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞生长抑制率;免疫组化SP法检测30例胃癌组织和15例癌旁组织中TL
2、R9的表达，并分析其与患者临床病理特征的关系。结果Western-blot法检测到TLR9在胃癌细胞系MGC803中有表达;2Mg?mL-l和5Mg?mL-lCpGODN仅在作用的72h有抑制胃癌细胞增殖的作用(PvO.Ol),而10Mg?mL-lCpGODN作用24、48h和72h均能显著抑制该细胞的增殖(PvO.Ol);免疫组化结杲显示，在胃癌组织和癌旁组织中均有TLR9的表达，且癌旁组织TLR9的表达高于胃癌组织(PvO.05);高、屮分化组TLR9的表达高于低分化组(P<0.05)沬观察到TLR9蛋片的表达与患者的性别、
3、年龄、肿瘤大小、部位、TNM分期和淋巴结转移具有相关性。结论TLR9在胃癌中有表达，且与肿瘤分化程度有关。【关键词】CpGODN;TLR9;胃癌胃癌具有发生率高、侵袭性强的特点，胃癌细胞的生物学行为与临床病理变化有一定的关系，但其中涉及的分子机制仍不清楚oToll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)在识别病原相关分了模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)中起重要作用。大量研究已证实，TLRs在肿瘤发生、发展过程中既可能促进肿瘤生长也可能发生抗肿瘤效应，并且
4、TLRs的表达与肿瘤的某些临床病理特征有相关性，如淋巴转移、肿瘤分期、分化程度等。TLR9是否参与胃癌发生发展过程，目前询不清楚。木研究以胃癌细胞系MGC803、胃癌组织及癌旁组织为研究对象，观察TLR9在胃癌的表达情况及其与胃癌临床病理特征的相关性。1材料和方法1」材料MGC803细胞为木室保存;RPMI1640培养基购自GBICO公司;四甲基偶氮卩坐盐(MTT)购自Amresco公司;胎牛血清购自民海生物公司;TLR9激动剂CpGODN1826(5,-tccatgacgttcctgacgtt-31,全程硫代修饰)由北京赛百盛
5、生物基因技术有限公司合成;胃癌组织和癌旁组织均由宁夏医科人学总医院病理科提供;TLR9抗体购自abeam公司；SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2方法1.2.1Western-blot方法测定胃癌细胞系MGC8O3TLR9的表达培养细胞达到80%〜90%以上的融合状态时，改用含2%胎牛血清的RPMI1640培养。提取肿瘤细胞总蛋口行BCA定量，取40Mg上样,SDS-PAGE电泳分离蛋白，PVDF膜在60V,300mA,4°C恒流条件下转膜3h,5%脱脂奶粉4。C封闭过復，TBST洗3次，鼠抗人TLR9单克隆抗体1
6、：100的工作浓度下37°C孵育3h,TBST洗3次后用羊抗鼠二抗1：100工作浓度下37°C孵育2h后仍用TBST洗涤，DAB显色，ECL发光及曝光，将胶片进行拍照。1.2.1MTT法检测细胞增殖活性按常规方法用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，在37°C、5%CO2饱和湿度的孵箱中对胃癌细胞MGC8O3进行培养。选取处于对数生长期且细胞活性大于98%的细胞进行实验。调整细胞浓度为2X107/L加入96孔培养板。实验分为四组，细胞对照组;加药组①:2Mg?mL-l的CpGODN组;加药组②：5Mg?mL-1的CpGO
7、DN组;加药组③：10Mg?mL-l的CpGODN组，每组各设3个复孔。分别作用24、48h和72h后，终止培养，每孔加入终浓度5Mg?mL-l的MTT10ML,37°C孵育3h后，在酶标仪上测定450nm波长下各孔A值。1.2.3免疫组化SP法检测胃癌组织和癌旁组织TLR9的表达操作严格按SP试剂盒说明书进行。结果判断：TLR9以细胞浆和(或)细胞膜呈棕黄色或棕褐色为阳性。400倍光镜下每张切片随机取10个高倍视野阳性细胞百分率，最后取两位病理学专家计算百分率的平均值。以TLR9表达阳性细胞率210%为阳性(+),275%为强
8、阳性(++),<10%为阴性(・)。1.3统计学方法全部数据采用SPSS11.5处理，计数资料以百分率表示，采用X2检验或Fisher确切概率法;计量资料的组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2」TLR9在胃癌细胞MGC803的表达West
