《论文 TLR9表达与胃癌临床病理特征关系的初步研 究(定稿)》.doc

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1、TLR9表达与胃癌临床病理特征关系的初步研究作者：马亚军I,张艳丽1,崔柳1,李秀萍2作者单位：1.宁夏医科大学;2.宁夏医科大学总医院【摘要】目的观察TLR9在胃癌中的农达及其与胃癌临床病理特征的关系。方法运用Western-blot方法测定胃癌细胞系MGC8O3TLR9的表达;用不同浓度的TLR9激动剂CpGODN(2、5>I0g?mL-l)分别作用于胃癌细胞系MGC8O3不同时间(24、48、72h)后，用四甲基偶氮卩坐盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞生长抑制率;免疫组化SP法检测30例胃癌组织和15例癌旁组织中TLR9的表达，并分析英与患者临床病理特征的

2、关系。结果Western-blot法检测到TLR9在胃癌细胞系MGC8O3中有表达;2g?mL-1和5g?mL-1CpG0DN仅在作用的72h有抑制胃癌细胞增殖的作用(P0.0I),而10g?mL-lCpGODN作用24、48h和72h均能昭著抑制该细胞的增殖(P0.01);免疫纽化结果显示，在胃癌纽织和癌旁组织中均有TLR9的表达，且癌旁纽.织TLR9的衣达高于胃癌组织(P0.05);高、中分化纽TLR9的表达高于低分化组(P0.05);未观察到TLR9蛋白的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、部位、TNM分期和淋巴结转移具有相关性。结论TLR9在胃癌中有表达，且与肿

3、瘤分化程度有关.【关键词】CpGODN;TLR9;胃癌胃癌具有发生率高、侵袭性强的特点，胃癌细胞的生物学行为与临床病理变化有一定的关系，但英中涉及的分子机制仍不淸楚［1］。Toll样受^(Toll-likereceptors,TLRs)在识别病证实,TLRs在肿瘤发生、发展过程屮既可能促进肿瘤生长也可能发生抗肿瘤效应，并且TLRs的表达与肿瘤的某些临床病理特征有相关性，如淋巴转移、肿瘤分期、分化程度等。TLR9是否参与胃癌发生发展过程，目前尚不清楚。本研究以胃癌细胞系MGC803.胃癌组织及癌旁纽•织为研究対象，观察TLR9在胃癌的表达情况及英与胃癌临床病理特征的相关

4、性。1材料和方法1」材料MGC803细胞为本室保存;RPMI1640培养基购自GBICO公司;四甲基偶氮I坐盐(MTT)购自Amresco公司;胎牛血清购自民海生物公司;TLR9激动剂CpGODN1826(55-tccatgacgttcctgacgtt-3^,全程硫代修饰)山北京赛方盛生物基因技术有限公司合成;胃癌纽织和癌旁纽织均山宁夏医科大学总医院病理科提供;TLR9抗体购自abeam公司;SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2方法1.2.1Western-blot方法测定胃癌细胞系MGC803TLR9的表达培养细胞达到80%〜90%以上的融合状态吋，改

5、用含2%胎牛Hll•清的RPMI1640培养。提収肿瘤细胞总蛋白行BCA定量，収40g上样,SDS-PAGE电泳分离蛋白，PVDF膜在60V,300mA,4C恒流条件下转膜3h,5%脱脂奶粉4C封闭过栈，TBST洗3次，鼠抗人TLR9单克隆抗体1：100的工作浓度下37C孵育3h,TBST洗3次后用羊抗鼠二抗1:100工作浓度下37C孵育2h后仍用TBST洗涤，DAB显色，ECL发光及曝光，将胶片进行拍照。1.2.2MTT法检测细胞增殖活性按常规方法用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，在3TC、5%CO2饱和湿度的孵箱中对胃癌细胞MGC8O3进行培养。选収处

6、于对数生长期且细胞活性大丁98%的细胞进行实验。调整细胞浓度为2107/L加入96孔培养板。实验分为四组，细胞对照纽;加药纽•①：2g?mL-1的CpGODN组;加药组②：5g?mL-l的CpGODN组;加药纽.③：IOg?mL-l的CpGODN组,每组各设3个复孔。分别作用24、48h和72h后,终止培养，每孔加入终浓度5g?mL-1的MTT10L,37°C孵育3h后，在酶标仪上测定450nm波长下各孔A值。1.2.3免疫组化SP法检测胃癌纽.织和癌旁组织TLR9的表达操作严格按SP试剂盒说明书进行。结果判断：TLR9以细胞浆和(或)细胞膜呈棕黄色或棕褐色为阳性。4

7、00倍光镜下每张切片随机取10个高倍视野阳性细胞百分率，最后収两位病理学专家计算百分率的平均值。以TLR9衣达阳性细胞率10%为阳性(+),75%为强阳性(++),10%为阴性(・)。1.3统计学方法全部数据采用SPSS11.5处理，计数资料以百分率表示，采用2检验或Fisher■确切概率法;计量资料的组间比较采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2」TLR9在胃癌细胞MGC803的农达Western-blot法测定结果显示胃癌细胞MGC803中有TLR9的农达，见图1。图1Western七lot法检测TLR9的衣达1.2CpGODN对MG