资源描述：
《《论文_TLR9表达与胃癌临床病理特征关系的初步研究(定稿)》》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、TLR9表达与胃癌临床病理特征关系的初步研究作者:马亚军1,张艳丽1,崔柳1,李秀萍2作者单位：1.宁夏医科大学;2.宁夏医科大学总医院【摘要】目的观察TLR9在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系。方法运用Western-blot方法测定円癌细胞系MGC803TLR9的表达;川不同浓度的TLR9激动剂CpG0DN(2、5、10g?mL-l)分别作用于胃癌细胞系MGC803不同时间(24、48、72h)后,用四甲基偶氮呻盐微量晦反应比色法(MTT法)检测细胞牛氏抑制率;免疫组化SP法检测30
2、例冒癌纽织和15例癌旁纽织中TLR9的表达，并分析其与患者临床病理特征的关系。结果Western-blot法检测到TLR9在胃癌细胞系MGC8O3中有表达;2g?mL-l和5g?mL-lCpG0DN仅在作用的72h有抑制胃癌细胞增殖的作用(P0.0I),而10g?mL-lCpGODN作用24、48h和72h均能显著抑制该细胞的增殖(P0.01);免疫组化结果显示，在胃癌组织和癌旁组织屮均有TLR9的表达，H癌旁组织TLR9的表达高于胃癌组织(P().05);高、屮分化组TLR9的衣达高于低分化纟
3、IKP0.05);未观察到TLR9蛋白的表达与患者的性別、年龄、肿瘤大小、部位、TNM分期和淋巴结转移具有相关性。结论TLR9在胃癌中有表达，H与肿瘤分化程度有关。【关键词】CpGODN;TLR9;胃癌胃癌具有发牛率高、侵袭性强的特点，胃癌细胞的牛物学行为与临床病理变化有一定的关系，但其中涉及的分子机制仍不清楚［1］。Toll样受体(Toll・likereceptors,TLRs)在识别病证实,TLRs在肿瘤发生、发展过程中既可能促进肿瘤生长也可能发生抗肿瘤效应，并口TLRs的表达与肿瘤的某些临
4、床病理特征有相关性，如淋巴转移、肿瘤分期、分化程度等。TLR9是否参与胃癌发生发展过程，目前尚不清楚。木研究以胃癌细胞系MGC8O3、胃癌纽织及癌旁组织为研究对象，观察TLR9在胃癌的表达情况及其与胃癌临床病理特征的相关性。1材料和方法1」材料MGC803细胞为本室保存;RPMI1640培养基购口GBICO公司;四甲基偶氮岬盐(MTT)购自Amresco公司;胎牛血清购自民海生物公司;TLR9激动剂CpGODN1826(5,-tccatgacgttcctgacgtt-3?,全程硫代修饰)山北京赛
5、百盛生物基因技术有限公司合成;胃癌组织和癌旁组织均由宁夏医科大学总医院病理科提供;TLR9抗体购口abeam公司;SP试剂盒购口北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2方法1.2.1Western-blot方法测定胃癌细胞系MGC803TLR9的表达培养细胞达到80%〜90%以上的融合状态吋，改用含2%胎牛血清的RPMI1640培养。提取肿瘤细胞总蛋白行BCA定量，取40g上样,SDS-PAGE电泳分离蛋白，PVDF膜在60V,300mA,4C恒流条件下转膜3h,5%脱脂奶粉4C封闭过夜，TBST洗
6、3次，鼠抗人TLR9单克隆抗体1：100的工作浓度下37C孵育3h,TBST洗3次后用羊抗鼠二抗1：100工作浓度下37C孵育2h后仍用TBST洗涤，DAB显色，ECL发光及曝光，将胶片进行拍照。1.2.2MTT法检测细胞增殖活性按常规方法用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,在37°C、5%CO2饱和湿度的孵箱中对胃癌细胞MGC8O3进行培养。选取处于对数牛长期且细胞活性大于98%的细胞进行实验。调整细胞浓度为2107/L加入96孔培养板。实验分为四组，细胞对照组;加药组①：2g?mL
7、-l的CpGODN组;加药组②：5g?mL-I的CpGODN组;加药组③：10g?mL-l的CpGODN组，每组各设3个复孔。分别作用24、48h和72h后，终止培养，每孔加入终浓度5g?mL-l的MTT10L,37°C孵育3h后，在酶标仪上测定450nm波长卜各孔A值。1.2.3免疫组化SP法检测胃癌组织和癌旁组织TLR9的表达操作严格按SP试剂盒说明书进行。结杲判断：TLR9以细胞浆和(或)细胞膜呈棕黄色或棕褐色为阳性。400倍光镜下每张切片随机取10个高倍视野阳性细胞百分率，授后取两位病理
8、学专家计算白分率的平均值。以TLR9表达阳性细胞率10%为阳性(+),75%为强阳性(++),10%为阴性(・)。1.3统计学方法全部数据采用SPSS11.5处理，计数资料以百分率表示，采用2检验或Fisher确切概率法;计量资料的组间比较采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2」TLR9在胃癌细胞MGC803的表达Western-blot法测定结果显示胃癌细胞MGC8O3屮有TLR9的表达，见图1。图1Western-blot法检测TLR9的衣达1.2CpGODN对MGC803细胞生
