pegfpn1linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在mhcc97中的表达

《pegfpn1linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在mhcc97中的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、pEGFPN1linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在MHCC97中的表达【摘要】目的：构建携带木薯亚麻苦甙水解酶(lis)基因,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导入人肝癌细胞MHCC97中表达.方法：提取木薯总RNA，PCR扩增lis目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFPN1上,构建重组质粒载体.利用电穿孔转染体外培养的MHCC97,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lisEGFP融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测lis基因转录水平的表达;HCC97细胞后，HCC97细胞表达,用荧光显

2、微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论：成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN1lis,可为后续lis基因功能的研究奠定实验基础.【关键词】木薯亚麻苦甙水解酶；聚合酶链反应；基因转染；自杀基因　　【Abstract】AIM:ToconstructpEGFPN1linamaraseeukaryoticexpressionvectorusinggreenfluorescenceproteinasreportorgeneandtransfectMHCC97cellsarase(lis)genesplifiededplasmidbymeansofe

3、lectrotransfer.ThelisEGFPfusedproteinicroscope,andtheexpressionoflinamaraseedigestionandsequenceanalysisshoeanicroscope.CONCLUSION:ConstructingtheexpressionvectorpEGFPN1lissuccessfully,itprovidesagoodbasisforfurtherresearchongenetherapyfortumour.　　【Keyarase；PCR；genetransfertechni

4、ques；suicidegene　　0引言　　近年来，自杀基因已经成为新的肿瘤治疗手段［1］，但由于已有的自杀基因系统存在着杀伤效率低等问题，因此，提高自杀基因的杀伤效率及旁观者效应已成为现阶段的研究热点.有研究［2-5］表明，源自木薯的新型自杀基因系统亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙（linamarase/linamarin,lis/lin）对肿瘤细胞具有杀伤作用，能够有效的杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长,但有关lis/lin系统的功能仍不十分清楚［6］.本研究拟从木薯中获得lis基因，构建真核表达载体pEGFPN1lis，转染MHCC97细胞，建立稳定表达lis

5、基因的细胞系，并对其在MHCC97细胞中表达加以鉴定，为深入研究lis/lin自杀基因系统功能提供依据.　　1材料和方法　　1.1材料pEGFPN1质粒由西京医院肝胆外科李韧博士惠赠.限制性内切酶、DNA连接酶（日本TaKaRa公司）；反转录试剂盒（美国Fermentas公司）；凝胶回收纯化试剂盒（美国Promega公司）；DMED高糖培养基，胎牛血清（美国Gibco公司）；TaqPlusDNA聚合酶，RNAplant试剂盒（北京TIANGEN公司）；蛋白质杂交免疫印记ECL化学发光试剂盒（上海卓康公司）.大肠杆菌DH5α和MHCC97细胞由西京医院肝胆外科

6、实验室保存.　　1.2方法　　1.2.1引物设计与合成根据lis基因的序列设计引物.上游引物为：5′ACTCTCGAGATGCTCGTCTTGTTCATAAG3′；下游引物为：3′CGAGTCGACAACATCACATAGAATTTGC5′.其中分别在上游和下游引物5′端加上XhoI和SalI酶切位点.DNA测序及引物合成由北京奥科公司完成.　　1.2.2lis基因的获取将新鲜的木薯芽在液氮中研磨破解细胞壁，通过RNAplant试剂盒提取木薯总RNA，所得RNA加入适量的无酶水溶解备用.按反转录试剂盒说明将提取的RNA转录为cDNA.采用PCR方式扩增

7、lis基因，25μL反应体系为：3.0μL上游及下游引物,2μLcDNA模板，12.5μLTaqPlusMasterMix，7.5μL无酶水.PCR反应条件：94℃30s，62.5℃1min，72℃2min，共35个循环；72℃延伸10min.反应结束后10g/L琼脂糖凝胶电泳分析.　　1.2.3lis重组真核表达载体的构建将PCR产物和提纯的pEGFPN1质粒分别经XhoI和SalI双酶切，酶切产物经10g/L琼脂糖电泳后回收.在T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态菌,卡那霉素筛选，挑取阳性克隆进行酶切鉴定，阳性克隆的质粒DNA经测序分析后命名

8、为pEGFPN1lis.　　1.2