pegfpn1linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在mhcc97中的表达论文

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1、pEGFPN1linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在MHCC97中的表达论文马俊陈明浩窦科峰李军郑伟霍斌亮张福琴李海民【摘要】目的：构建携带木薯亚麻苦甙水解酶(lis)基因,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导入人肝癌细胞MHCC97中表达.方法：提取木薯总RNA，PCR扩增lis目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFPN1上,构建重组质粒载体.利用电穿孔转染体外培养的MHCC97,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lisEGFP融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测

2、lis基因转录水平的表达;HCC97细胞后，HCC97细胞表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论：成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN1lis,可为后续lis基因功能的研究奠定实验基础.【关键词】木薯亚麻苦甙水解酶；聚合酶链反应；基因转染；自杀基因【Abstract】AIM:ToconstructpEGFPN1linamaraseeukaryoticexpressionvectorusinggreenfluorescenceproteinasreportorgeneandtransfectMHCC9

3、7cellsarase(lis)genesplifiededplasmidbymeansofelectrotransfer.ThelisEGFPfusedproteinicroscope,andtheexpressionoflinamaraseedigestionandsequenceanalysisshoeanicroscope.CONCLUSION:ConstructingtheexpressionvectorpEGFPN1lissuccessfully,itprovidesagoodbasisforfurtherresea

4、rchongenetherapyfortumour.【Keyarase；PCR；genetransfertechniques；suicidegene0引言近年来，自杀基因已经成为新的肿瘤治疗手段［1］，但由于已有的自杀基因系统存在着杀伤效率低等问题，因此，提高自杀基因的杀伤效率及旁观者效应已成为现阶段的研究热点.有研究［2-5］表明，源自木薯的新型自杀基因系统亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙（linamarase/linamarin,.freelentas公司）；凝胶回收纯化试剂盒（美国Promega公司）；DMED高糖培养基，胎牛血清（美国

5、Gibco公司）；TaqPlusDNA聚合酶，RNAplant试剂盒（北京TIANGEN公司）；蛋白质杂交免疫印记ECL化学发光试剂盒（上海卓康公司）.大肠杆菌DH5α和MHCC97细胞由西京医院肝胆外科实验室保存.1.2方法1.2.1引物设计与合成根据lis基因的序列设计引物.上游引物为：5′ACTCTCGAGATGCTCGTCTTGTTCATAAG3′；下游引物为：3′CGAGTCGACAACATCACATAGAATTTGC5′.其中分别在上游和下游引物5′端加上XhoI和SalI酶切位点.DNA测序及引物合成由北京奥科公

6、司完成.1.2.2lis基因的获取将新鲜的木薯芽在液氮中研磨破解细胞壁，通过RNAplant试剂盒提取木薯总RNA，所得RNA加入适量的无酶水溶解备用.按反转录试剂盒说明将提取的RNA转录为cDNA.采用PCR方式扩增lis基因，25μL反应体系为：3.0μL上游及下游引物,2μLcDNA模板，12.5μLTaqPlusMasterMix，7.5μL无酶水.PCR反应条件：94℃30s，62.5℃1min，72℃2min，共35个循环；72℃延伸10min.反应结束后10g/L琼脂糖凝胶电泳分析.1.2.3lis重组真核表达载体的构建

7、将PCR产物和提纯的pEGFPN1质粒分别经XhoI和SalI双酶切，酶切产物经10g/L琼脂糖电泳后回收.在T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态菌,卡那霉素筛选，挑取阳性克隆进行酶切鉴定，阳性克隆的质粒DNA经测序分析后命名为pEGFPN1lis.1.2.4建立稳定转染lis基因的MHCC97细胞系消化法收集3×106个处于对数生长期MHCC97细胞，分别同20μgpEGFPN1lis质粒和20μgpEGFPN1质粒混匀，置于400μL的穿孔杯中，800V，5ms电穿转染，转染后接种于24孔板中.转染24h后

8、，改用含有G418选择性培基（600mg/L）中加压筛选约4in，72℃2min，共34个循环；72℃延伸10min.取等体积PCR产物进行10g/L凝胶电泳分析结果.1.2.6HCC97EGFP细胞和MHCC97l