pEGFPC2GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达.doc

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1、pEGFPC2GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达作者：张金平，王巍，张雷，王慧娟，赵春芳，陈炜，赵秀军【摘要】目的：构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFPC2GATA4，并检验其在P19细胞中的瞬时表达.方法：以真核表达质粒pEFSAGATA4为模板，PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段，将目的片段亚克隆到pEGFPC2载体，卡那霉素筛选阳性克隆，经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定.将重组质粒pEGFPC2GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞，用免

2、疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达.结果：酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFPC2载体，并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4EGFP融合蛋白表达.结论：成功构建真核表达质粒pEGFPC2GATA4，并在P19细胞瞬时表达成功，为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础.【关键词】pEGFPC2载体；GATA4；真核表达质粒；P19细胞；转染0引言　　GATA4是GATA锌指转录因子家族中的一员，具有结合

3、核酸共同序列GATA的特性，是目前研究最多的与心脏发育密切相关的转录调控因子之一［1］.GATA4作为心脏前体细胞的最早标志之一，在调节心肌细胞的发生、分化以及心肌前体细胞形成线状心管等过程中发挥重要作用［2］.为进一步研究转录因子GATA4在心脏发育及心肌分化中的作用，本研究构建了含有小鼠GATA4编码框的pEGFPC2GATA4真核表达载体，并在P19细胞中瞬时表达成功，为进一步研究心脏特异转录因子的功能及调控机制奠定了基础.1材料和方法1.1材料限制性内切酶EcoRI,XbaI和HindⅢ购

4、自TaKaRa，转染试剂Lipofectamine2000和培养基αMEM购自invitrogen公司，DNA回收试剂盒、T4DNA连接酶、DNAmarker购自宝生物公司，PCR试剂盒购自赛百盛公司，质粒抽提试剂盒购自Promega公司，pEFSAGATA4质粒由日本HiroshiAKAZAWA博士惠赠，pEGFPC2载体、感受态菌株DH5α由本实验室保存.P19细胞系来源于中国武汉细胞库.胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素、SP免疫组化即用型试剂盒、兔GATA4一抗（Santa公司）均购于博海生物

5、公司.1.2方法51.2.1PCR扩增GATA4基因编码框以pEFSAGATA4质粒为模板，上游引物：5′GCCGGAATTCATGTACCAAAGCCTGGCCATGGC3′，引入酶切位点EcoRI；下游引物：5′GCGCTCTAGATTACGCGGTGATTATGTCCCCATGA3′，引入酶切位点XbaI.反应体系如下：10×Buffer(含MgCl2)2.5μL，5mmol/LdNTP2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，质粒模板DNA0.5μL，5U/μLExTaq酶0.2μL

6、，补水至25μL，瞬时离心混匀，循环参数：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃80s，25个循环；72℃10min.反应完毕后，琼脂糖凝胶电泳，割胶回收靶片断，回收步骤参见宝生物溶胶回收试剂盒.1.2.2酶切和连接将上一步回收纯化的DNA和载体pEGFPC2用XbaI和EcoRI限制性内切酶分别消化并再次回收.酶切体系如下：BufferM5μL,BSA5μL,待切DNA30μL,XbaI1μL,补水至50μL.酶切条件：37℃，2h,再加5μLBufferH，混匀后加EcoRI2μL进

7、行酶切，37℃，2h.回收后将二者连接，连接体系：LigationBuffer1μL,T4DNA连接酶1μL,Gata4扩增后酶切并回收产物2μL,pEGFPC2酶切回收产物2μL,共10μL，短暂离心混匀后，置16℃恒温过夜.1.2.3转化大肠杆菌、阳性克隆菌落PCR鉴定连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，涂布于含抗生素Kana的LB培养基上，培养16～24h，挑取多个阳性菌落,进行PCR鉴定，PCR反应体系、循环参数和引物同上.1.2.4重组质粒酶切及测序验证挑取阳性菌落，Promeg

8、a质粒抽提试剂盒抽提重组质粒，经酶切鉴定，并送上海生工测序.1.2.5P19细胞的培养和质粒转染P19细胞生长培养基配制：αMEM培养液含100mL/L胎牛血清、青霉素1万U/L、链霉素100mg/L，pH7.2～7.4.于50mL/LCO2，37℃条件下培养，待贴壁后换液体，细胞长满后传代，之后每2d传代1次.取传代4次以上的细胞，按Lipofectamine2000转染试剂操作步骤转染质粒.1.2.6GATA4基因和EGFPGATA4融合蛋白的检