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1、真核表达载体pEGFPclaudin1的构建【摘要】目的:构建真核表达载体pEGFPclaudin1,并在293T细胞中进行表达。方法:用反转录聚合酶链反应（RTPCR）方法扩增claudin1开放读码框（ORF）基因,将其插入到pEGFPC3载体的XhoI和BamHI酶切位点,构建真核表达载体pEGFPclaudin1,酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染293T细胞,进行荧光检测和r)49000的蛋白条带。结论:成功地构建真核表达载体pEGFPclaudin1,并在293T细胞中表达,为研究claudin1的功能奠定了基础。【关键词】claudin1
2、绿色荧光蛋白真核表达载体293T细胞Claudin1是一种紧密连接蛋白,属于claudin家族成员,在肝脏中高度表达,其他上皮组织中也有表达[1]。近年的研究发现,claudin1的异常表达与肿瘤的发生密切相关[2,3],成为这一领域研究的热点。最近,Evans等[4]发现claudin1作为辅受体在HCV入胞过程中发挥重要作用,使人们对claudin1有了新的认识,为深入理解HCV感染的分子机制开辟了新的思路。为此,本实验我们构建了人claudin1基因的真核表达载体,将其转染293T细胞进行了表达,为研究claudin1与HCV感染的关系奠定基础。 1材料和方
3、法 1.1材料 菌株DH5α、HepG2细胞由本实验室保存,293T细胞由第四军医大学基础部遗传与发育生物学教研室韩骅教授惠赠;pEGFPC3载体购自BDClontech公司;TRIzol试剂、PlatinumTaq酶、PureLinkTM质粒小量提取试剂盒、Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;RevertAidTM第1链cDNA合成试剂盒,PageRulerTM蛋白marker购自Fermentas公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根公司;限制性内切酶、T4连接酶和DNAmarkerDL2000购自TaKaRa公司;抗GFP多克隆抗体购
4、自eBioscience公司,小鼠抗兔IgG二抗为晶美公司产品。 1.2方法 1.2.1总RNA的提取 按TRIzol试剂的使用说明提取HepG2细胞总RNA。 1.2.2claudin1引物的设计与合成 参照claudin1核苷酸序列(GenBank注册号为NM021101),设计如下引物:上游引物为5′ATCTCGAGATGGCCAACGCGGGGCTGCAG3′,下游引物为5′GTGGATCCTCACACGTAGTCTTTCCCGCTG3′。引物中划横线的碱基序列分别为XhoI和BamHI的酶切位点,引物由北京博迈德科技公司合成。 1.2.3cD
5、NA合成及PCR扩增、纯化及克隆 应用随机引物,使用Fermentas公司RevertAidTM第1链cDNA合成试剂盒合成第1链cDNA。以cDNA为模版,分别用claudin1上下游引物进行扩增,PCR扩增条件:94℃变性5min;94℃45s,64℃45s,72℃1min,35个循环;72℃10min结束扩增。PCR产物于10g/L琼脂糖凝胶上电泳分离后纯化。 1.2.4载体的构建 用限制性内切酶XhoI,BamHI消化PCR产物及pEGFPC3载体,胶回收试剂盒回收目的片段及载体,T4连接酶4℃连接过夜,转化到DH5α感受态细菌,挑克隆,PCR及酶切筛选和鉴
6、定重组质粒。阳性克隆抽提质粒后测序,序列测定由上海Invitrogen公司完成,DNAStar软件进行核苷酸序列分析。 1.2.5转染293T细胞 将293T细胞接种于6孔板,80%～90%细胞满底后,采用pEGFPclaudin1质粒4μg和lipofectamine200010μL按试剂盒说明进行转染,同时以转染pEGFPC3质粒的细胞株为对照。 1.2.6荧光检测 转染后48h取细胞爬片,用PBS洗涤2次,再以双蒸水洗3次,滴加500mL/L甘油缓冲液封片,于荧光显微镜下观察阳性细胞。 1.2.7r27000条带,融合蛋白在约Mr49000处显示特异性条
7、带（图4）,符合GFP及目的蛋白Mr的大小。 3讨论Claudin家族是构成紧密连接的主要蛋白分子,有24个成员,Mr在20000～27000之间,与Occludin、连接黏附分子构成了细胞间的紧密连接,阻止膜蛋白及液体的侧向扩散,从而维持细胞顶端和基底区的不同组分构成。因此,在维持细胞极性中起重要作用。Claudin1有4个疏水的跨膜区,2个细胞外环状结构（extracellularloops,EL）,EL2是细菌毒素的受体,氨基端和羧基端均位于胞质中[5],羧基端参与信号转导,通过PDZ(pos
