pegfpc2gata4真核表达载体的构建及在p19细胞中的表达

pegfpc2gata4真核表达载体的构建及在p19细胞中的表达

ID:15110953

大小:37.00 KB

页数:10页

时间:2018-08-01

pegfpc2gata4真核表达载体的构建及在p19细胞中的表达_第1页
pegfpc2gata4真核表达载体的构建及在p19细胞中的表达_第2页
pegfpc2gata4真核表达载体的构建及在p19细胞中的表达_第3页
pegfpc2gata4真核表达载体的构建及在p19细胞中的表达_第4页
pegfpc2gata4真核表达载体的构建及在p19细胞中的表达_第5页
资源描述:

《pegfpc2gata4真核表达载体的构建及在p19细胞中的表达》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库

1、pEGFPC2GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达作者:张金平,王巍,张雷,王慧娟,赵春芳,陈炜,赵秀军【摘要】目的:构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFPC2GATA4,并检验其在P19细胞中的瞬时表达.方法:以真核表达质粒pEFSAGATA4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段,将目的片段亚克隆到pEGFPC2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定.将重组质粒pEGFPC2GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,

2、用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达.结果:酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFPC2载体,并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4EGFP融合蛋白表达.结论:成功构建真核表达质粒pEGFPC2GATA4,并在P19细胞瞬时表达成功,为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础.【关键词】pEGFPC2载体;GATA4;真核表达质粒;P19细胞;转染0引言10  GATA4是GATA锌指转录因子家族中的一

3、员,具有结合核酸共同序列GATA的特性,是目前研究最多的与心脏发育密切相关的转录调控因子之一[1].GATA4作为心脏前体细胞的最早标志之一,在调节心肌细胞的发生、分化以及心肌前体细胞形成线状心管等过程中发挥重要作用[2].为进一步研究转录因子GATA4在心脏发育及心肌分化中的作用,本研究构建了含有小鼠GATA4编码框的pEGFPC2GATA4真核表达载体,并在P19细胞中瞬时表达成功,为进一步研究心脏特异转录因子的功能及调控机制奠定了基础.1材料和方法1.1材料限制性内切酶EcoRI,Xba

4、I和HindⅢ购自TaKaRa,转染试剂Lipofectamine2000和培养基αMEM购自invitrogen公司,DNA回收试剂盒、T4DNA连接酶、DNAmarker购自宝生物公司,PCR试剂盒购自赛百盛公司,质粒抽提试剂盒购自Promega公司,pEFSAGATA4质粒由日本HiroshiAKAZAWA博士惠赠,pEGFPC2载体、感受态菌株DH5α由本实验室保存.P19细胞系来源于中国武汉细胞库.胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素、SP免疫组化即用型试剂盒、兔GATA4一抗(Santa

5、公司)均购于博海生物公司.1.2方法101.2.1PCR扩增GATA4基因编码框以pEFSAGATA4质粒为模板,上游引物:5′GCCGGAATTCATGTACCAAAGCCTGGCCATGGC3′,引入酶切位点EcoRI;下游引物:5′GCGCTCTAGATTACGCGGTGATTATGTCCCCATGA3′,引入酶切位点XbaI.反应体系如下:10×Buffer(含MgCl2)2.5μL,5mmol/LdNTP2μL,上游引物1μL,下游引物1μL,质粒模板DNA0.5μL,5U/μ

6、LExTaq酶0.2μL,补水至25μL,瞬时离心混匀,循环参数:95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃80s,25个循环;72℃10min.反应完毕后,琼脂糖凝胶电泳,割胶回收靶片断,回收步骤参见宝生物溶胶回收试剂盒.1.2.2酶切和连接将上一步回收纯化的DNA和载体pEGFPC2用XbaI和EcoRI限制性内切酶分别消化并再次回收.酶切体系如下:BufferM5μL,BSA5μL,待切DNA30μL,XbaI1μL,补水至50μL.酶切条件:37℃,2h,再加5μLBuffer

7、H,混匀后加EcoRI2μL进行酶切,37℃,2h.回收后将二者连接,连接体系:LigationBuffer1μL,T4DNA连接酶1μL,Gata4扩增后酶切并回收产物2μL,pEGFPC2酶切回收产物2μL,共10μL,短暂离心混匀后,置16℃恒温过夜.101.2.3转化大肠杆菌、阳性克隆菌落PCR鉴定连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞,涂布于含抗生素Kana的LB培养基上,培养16~24h,挑取多个阳性菌落,进行PCR鉴定,PCR反应体系、循环参数和引物同上.1.2.4重组质粒酶

8、切及测序验证挑取阳性菌落,Promega质粒抽提试剂盒抽提重组质粒,经酶切鉴定,并送上海生工测序.1.2.5P19细胞的培养和质粒转染P19细胞生长培养基配制:αMEM培养液含100mL/L胎牛血清、青霉素1万U/L、链霉素100mg/L,pH7.2~7.4.于50mL/LCO2,37℃条件下培养,待贴壁后换液体,细胞长满后传代,之后每2d传代1次.取传代4次以上的细胞,按Lipofectamine2000转染试剂操作步骤转染质粒.1.2.6GATA4基因和EGFPGATA4融

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。