欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:25337350
大小:55.50 KB
页数:7页
时间:2018-11-19
《pegfp-c2-gata4真核表达载体的构建及在p19细胞中的表达》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、pEGFP?C2?GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达张金平,王巍,张雷,王慧娟,赵春芳,陈炜,赵秀军【摘要】目的:构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP?C2?GATA4,并检验其在P19细胞中的瞬时表达.方法:以真核表达质粒pEFSA?GATA4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段,将目的片段亚克隆到pEGFP?C2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定.将重组质粒pEGFP?C2?GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GA
2、TA4在P19细胞中的表达.结果:酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFP?C2载体,并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4?EGFP融合蛋白表达.结论:成功构建真核表达质粒pEGFP?C2?GATA4,并在P19细胞瞬时表达成功,为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础.【关键词】pEGFP?C2载体;GATA4;真核表达质粒;P19细胞;转染0引言 GATA4是GATA锌指转录因子家族中的一员,具有结合核酸共同序列GATA的特性,是目前研究最多的与心脏发育密切相关的转录调控因子之一[1].GATA4作为心脏
3、前体细胞的最早标志之一,在调节心肌细胞的发生、分化以及心肌前体细胞形成线状心管等过程中发挥重要作用[2].为进一步研究转录因子GATA4在心脏发育及心肌分化中的作用,本研究构建了含有小鼠GATA4编码框的pEGFP?C2?GATA4真核表达载体,并在P19细胞中瞬时表达成功,为进一步研究心脏特异转录因子的功能及调控机制奠定了基础.1材料和方法1.1材料限制性内切酶EcoRI,XbaI和HindⅢ购自TaKaRa,转染试剂Lipofectamine2000和培养基α?MEM购自invitrogen公司,DNA回收试剂盒、T4DNA连接酶、DNAmark
4、er购自宝生物公司,PCR试剂盒购自赛百盛公司,质粒抽提试剂盒购自Promega公司,pEFSA?GATA4质粒由日本HiroshiAKAZAgCl2)2.5μL,5mmol/LdNTP2μL,上游引物1μL,下游引物1μL,质粒模板DNA0.5μL,5U/μLEx?Taq酶0.2μL,补水至25μL,瞬时离心混匀,循环参数:95℃5min,95℃30s,55℃30s,72℃80s,25个循环;72℃10min.反应完毕后,琼脂糖凝胶电泳,割胶回收靶片断,回收步骤参见宝生物溶胶回收试剂盒.1.2.2酶切和连接将上一步回收纯化的DNA和载体pEGFP?
5、C2用XbaI和EcoRI限制性内切酶分别消化并再次回收.酶切体系如下:BufferM5μL,BSA5μL,待切DNA30μL,XbaI1μL,补水至50μL.酶切条件:37℃,2h,再加5μLBufferH,混匀后加EcoRI2μL进行酶切,37℃,2h.回收后将二者连接,连接体系:LigationBuffer1μL,T4DNA连接酶1μL,Gata4扩增后酶切并回收产物2μL,pEGFP?C2酶切回收产物2μL,共10μL,短暂离心混匀后,置16℃恒温过夜.1.2.3转化大肠杆菌、阳性克隆菌落PCR鉴定连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞
6、,涂布于含抗生素Kana的LB培养基上,培养16~24h,挑取多个阳性菌落,进行PCR鉴定,PCR反应体系、循环参数和引物同上.1.2.4重组质粒酶切及测序验证挑取阳性菌落,Promega质粒抽提试剂盒抽提重组质粒,经酶切鉴定,并送上海生工测序.1.2.5P19细胞的培养和质粒转染P19细胞生长培养基配制:α?MEM培养液含100mL/L胎牛血清、青霉素1万U/L、链霉素100mg/L,pH7.2~7.4.于50mL/LCO2,37℃条件下培养,待贴壁后换液体,细胞长满后传代,之后每2d传代1次.取传代4次以上的细胞,按Lipofectamine20
7、00转染试剂操作步骤转染质粒.1.2.6GATA4基因和EGFP?GATA4融合蛋白的检测转染之后24h,于激光共聚焦扫描显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达;常规免疫细胞化学法显示GATA4蛋白的表达情况,兔GATA4一抗1∶50稀释;提取细胞DNA,PCR检测GATA4的基因表达:GATA4上游引物:5′?AAGACGCCAGCAGGTCCTGCTGGT?3′;下游引物:5′?CGCGGTGATTATGTCCCCATGACT?3′;GAPDH上游引物:5′?AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG?3′,下游引物:5′?AGGGGTCATTGATGG
8、CAACA?3′,反应体系如下:10×Buffer1.5μL,5mmol/LdNTP1μL,上游引物0.5μ
此文档下载收益归作者所有