pegfp-c2-gata4真核表达载体的构建及在p19细胞中的表达

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1、pEGFP?C2?GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达张金平，王巍，张雷，王慧娟，赵春芳，陈炜，赵秀军【摘要】目的：构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP?C2?GATA4，并检验其在P19细胞中的瞬时表达.方法：以真核表达质粒pEFSA?GATA4为模板，PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段，将目的片段亚克隆到pEGFP?C2载体，卡那霉素筛选阳性克隆，经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定.将重组质粒pEGFP?C2?GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞，用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GA

2、TA4在P19细胞中的表达.结果：酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFP?C2载体，并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4?EGFP融合蛋白表达.结论：成功构建真核表达质粒pEGFP?C2?GATA4，并在P19细胞瞬时表达成功，为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础.【关键词】pEGFP?C2载体；GATA4；真核表达质粒；P19细胞；转染0引言　　GATA4是GATA锌指转录因子家族中的一员，具有结合核酸共同序列GATA的特性，是目前研究最多的与心脏发育密切相关的转录调控因子之一［1］.GATA4作为心脏

3、前体细胞的最早标志之一，在调节心肌细胞的发生、分化以及心肌前体细胞形成线状心管等过程中发挥重要作用［2］.为进一步研究转录因子GATA4在心脏发育及心肌分化中的作用，本研究构建了含有小鼠GATA4编码框的pEGFP?C2?GATA4真核表达载体，并在P19细胞中瞬时表达成功，为进一步研究心脏特异转录因子的功能及调控机制奠定了基础.1材料和方法1.1材料限制性内切酶EcoRI,XbaI和HindⅢ购自TaKaRa，转染试剂Lipofectamine2000和培养基α?MEM购自invitrogen公司，DNA回收试剂盒、T4DNA连接酶、DNAmark

4、er购自宝生物公司，PCR试剂盒购自赛百盛公司，质粒抽提试剂盒购自Promega公司，pEFSA?GATA4质粒由日本HiroshiAKAZAgCl2)2.5μL，5mmol/LdNTP2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，质粒模板DNA0.5μL，5U/μLEx?Taq酶0.2μL，补水至25μL，瞬时离心混匀，循环参数：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃80s，25个循环；72℃10min.反应完毕后，琼脂糖凝胶电泳，割胶回收靶片断，回收步骤参见宝生物溶胶回收试剂盒.1.2.2酶切和连接将上一步回收纯化的DNA和载体pEGFP?

5、C2用XbaI和EcoRI限制性内切酶分别消化并再次回收.酶切体系如下：BufferM5μL,BSA5μL,待切DNA30μL,XbaI1μL,补水至50μL.酶切条件：37℃，2h,再加5μLBufferH，混匀后加EcoRI2μL进行酶切，37℃，2h.回收后将二者连接，连接体系：LigationBuffer1μL,T4DNA连接酶1μL,Gata4扩增后酶切并回收产物2μL,pEGFP?C2酶切回收产物2μL,共10μL，短暂离心混匀后，置16℃恒温过夜.1.2.3转化大肠杆菌、阳性克隆菌落PCR鉴定连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞

6、，涂布于含抗生素Kana的LB培养基上，培养16～24h，挑取多个阳性菌落,进行PCR鉴定，PCR反应体系、循环参数和引物同上.1.2.4重组质粒酶切及测序验证挑取阳性菌落，Promega质粒抽提试剂盒抽提重组质粒，经酶切鉴定，并送上海生工测序.1.2.5P19细胞的培养和质粒转染P19细胞生长培养基配制：α?MEM培养液含100mL/L胎牛血清、青霉素1万U/L、链霉素100mg/L，pH7.2～7.4.于50mL/LCO2，37℃条件下培养，待贴壁后换液体，细胞长满后传代，之后每2d传代1次.取传代4次以上的细胞，按Lipofectamine20

7、00转染试剂操作步骤转染质粒.1.2.6GATA4基因和EGFP?GATA4融合蛋白的检测转染之后24h，于激光共聚焦扫描显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达；常规免疫细胞化学法显示GATA4蛋白的表达情况，兔GATA4一抗1∶50稀释；提取细胞DNA，PCR检测GATA4的基因表达：GATA4上游引物:5′?AAGACGCCAGCAGGTCCTGCTGGT?3′；下游引物:5′?CGCGGTGATTATGTCCCCATGACT?3′；GAPDH上游引物:5′?AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG?3′,下游引物:5′?AGGGGTCATTGATGG

8、CAACA?3′,反应体系如下：10×Buffer1.5μL，5mmol/LdNTP1μL，上游引物0.5μ