aβ142诱导皮层神经元细胞凋亡的机制及通心络的干预作用

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1、Aβ142诱导皮层神经元细胞凋亡的机制及通心络的干预作用：张志慧周【摘要】目的探讨Aβ诱导皮层神经元凋亡的机制及通心络的干预作用。方法原代培养的小鼠皮层神经，经Aβ142处理后，MTT判断神经元存活率，Hoechst33342染色、流式细胞仪检测检测神经元凋亡，ethodsTheneuronsurvival,apoptosisofneuronsinedbyR4000型酶标仪、胎牛血清(Sigma公司)，培养基、胰蛋白酶(Trypsin，Sigma公司)，噻唑蓝(MTT，Sigma)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma)，caspase3抗体（SantaCruz)等。　　1.2皮层原代

2、神经元培养　　取怀孕14～16d昆明小鼠，75%乙醇浸泡消毒皮肤，取出胎鼠，无菌条件下断头取全脑，用眼科镊仔细剥除脑膜，切下双侧大脑皮层，剪碎，移入消化液中（0.125%胰酶，用0.01mol/LPBS配制），置37℃水浴箱中消化20min，每隔5～10min取出摇匀。待组织块下沉后，用巴氏滴管吸出上清液，加入含10%FBS（胎牛血清）的DMEM完全培养基2～3ml，静置5min终止胰酶消化。弃上清，将组织悬浮于完全培养基中，用尖端经火焰钝化的巴氏滴管缓慢吹打20～30次，待组织团块基本消失，静置数分钟，将上层细胞悬液经100目不锈钢网过滤，残余组织再加入含10％FBS的DMEM／F12

3、反复吹打，静置，悬液过滤。收集两次过滤的单细胞悬液进行计数，台盼蓝拒染法计数细胞活力。用含10％FBS的DMEM／F12（临用前添加L谷氨酰胺20μmol/L，葡萄糖3g/L）调整活细胞密度为1×106/L，接种于1％L多聚赖氨酸预包被的6孔或96孔培养板，每孔2ml，在37℃，5%CO2,95%空气及饱和湿度的细胞培养箱中孵育24h。细胞贴壁后，更换新鲜的含20%B27的无血清DMEM／F12，抑制胶质细胞的增殖。此后每隔3d换半液，培养至7～10d的神经细胞经神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学(SABC法)鉴定，神经元占95%以上。细胞生长至7～10d可用于药物干预试验。

4、　　1.3淀粉样蛋白的老化处理　　将1mgAβ142溶解在1ml的DMEM培养基中，置于37℃孵箱中孵育7d，使蛋白凝聚，然后-20℃贮存备用。　　1.4Aβ142损伤神经元的量效关系　　将上述神经元细胞种植在96孔培养板中，待细胞生长状态良好时加入含不同浓度Aβ142的DMEM培养液，100μl／孔。第1组细胞的处理：细胞长至亚融合状态时更换培养基并加入Aβ142，终浓度依次为10、20、40、80、160μmol／L，培养24h，以不加Aβ142的细胞为阴性对照。第2组细胞的处理：细胞长至亚融合状态时更换培养基并加入Aβ142(终浓度为40μmol／L)，于培养12、24

5、、36、48h终止培养，以不加Aβ142的细胞为阴性对照。终浓度为40mol/L作用24h适合建立细胞损伤模型。　　1.5分组及药物处理　　神经元细胞以106/ml密度接种于6孔板，实验分为①正常组：用5%FBS的DMEM培养基培养24h后进行检测；②模型组：细胞培养后，加入终浓度为40μmol/LAβ142作用24h诱导细胞损伤；③通心络组：细胞培养后，在加入Aβ前，分别加入终浓度为200、100、50μmol/L的通心络预处理4h，再加入终浓度为40μmol/LAβ142作用24h诱导细胞损伤。　　1.6细胞的形态学观察　　在倒置显微镜观察经各因素处理后神经元的形态学变化。　　

6、1.7MTT法检测细胞存活率　　细胞经上法处理后，吸去上清液，在无菌条件下每孔加入5mg/mlMTT100μl，继续培养4h，小心吸取培养液保存，每孔加入200μl的DMSO溶液，反复振荡30min，直至MTT反应的蓝色结晶产物完全溶解。用酶标仪检测490nm和630nm波长处每孔样品的吸光度值。　　2结果　　2.1形态学观察　　正常组皮质神经元培养7d后，胞体呈梭形或三角形，聚堆生长，相互交织成网状，折光性好。Aβ142损伤模型组细胞损伤严重。通心络各组均有改善，以大剂量为著（见图1）。　　2.2对原代神经元细胞存活率的MTT检测　　模型组与空白组原代神经元细胞存活率有显著差异(P&

7、lt;0.05)，100、200μmol/L两个浓度组的通心络可提高原代神经元细胞存活率(P<0.05)（见表1）。　　2.3Hoechst33342染色（荧光显微镜下观察）结果　　正常组皮质神经元呈低蓝染色，胞核和胞膜完整，Aβ142损伤模型组细胞损伤严重，细胞呈亮蓝染色，有些细胞呈典型的凋亡形态。通心络各组均有改善，以大剂量为著（图2）。表1通心络对Aβ142原代神经元细胞存活率的影响（略）　　2.4流式细胞仪检测凋亡