htrsirna腺病毒的构建及其体外抗肿瘤的初步研究

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1、hTRsiRNA腺病毒的构建及其体外抗肿瘤的初步研究：李燕,肖丽英,姚刚,李虹,杨志伟,李婉宜,蒋忠华,李明远【摘要】　　目的:构建RNA干扰（RNAi）腺病毒,通过体外实验观察其抑制肿瘤细胞中人端粒酶RNA（hTR）基因表达、降低瘤细胞中的端粒酶活性、以及促进肿瘤细胞凋亡等作用。方法:首先用一种新的体外连接法构建腺病毒AdhTRsiRNA,表达靶向hTR的小干扰RNA分子（siRNA）,用100MOI的重组腺病毒感染不同的肿瘤细胞系,再用TRAPELISA法测定细胞端粒酶活性、RealtimePCR测定hTR的mRNA水平、流式细胞术(FCM)

2、测定肿瘤细胞凋亡率及人端粒酶反转录酶（hTERT)的蛋白变化。结果:感染了AdhTRsiRNA的肿瘤细胞的端粒酶活性明显降低,其中以HeLa细胞降低最明显,其端粒酶活性抑制率达到58.87%,hTR的mRNA表达下调70.21%,细胞凋亡率为29.7%,但hTERT的蛋白表达并不被阻断。结论:AdhTRsiRNA可以有效、特异地抑制hTR基因表达,诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡,具有抗肿瘤活性;此结果提示AdhTRsiRNA在肿瘤基因治疗方面具有潜在的应用价值。【关键词】hTR腺病毒RNA干扰端粒酶抗肿瘤作用　　Constructionofaden

3、ovirusexpressingsiRNAagainsthTRanditsantitumoractivityinvitro　　LIYan,XIAOLiying,YAOGang,LIHong,YANGZhientofMicrobiology,edicine,SichuanUniversity,Chengdu610041;ChengduInstituteofBiologicalProducts,Chengdu610063,China　　[Abstract]AIM:TostudytheeffectofthehTRsiRNAadenovirusonhTRm

4、RNAgenesilence,telomeraseactivityinhibitionandantitumorinvitro.METHODS:RNAiadenovirusvector,AdhTRsiRNA,andnegativecontrolAdNTsiRNAprovedligationmethod.Differenttumorcellsandlivercellline,HL7702,ePCRandFCMeraseactivity,hTRmRNA,apoptosisrateandhTERTproteinexpression.RESULTS:As

5、paredRNAlevels(70.21%)andtelomeraseactivity(58.87%)ofHeLacellssignificantly,increasedapoptosisrate(29.7%).ButthetelomeraseactivityofHL7702andhTERTproteindidn'tshoorcellgrocouldbeaneethodforcancergenetherapy.　　[Keyerase;antitumor　　2006年的诺贝尔医学奖授给了发现RNA干扰（RNAinducedinterference,RN

6、Ai）现象的科学家[1],使目前广泛用于肿瘤和病毒所致疾病研究[2,3]的RNAi技术更是锦上添花。为达到稳定、高效的干扰效果,目前科研人员都比较推崇用病毒载体介导的细胞内小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)表达技术[3]。端粒酶是维持肿瘤细胞永生化的重要分子基础,通过抑制端粒酶活性来达到治疗恶性肿瘤的目的已成为肿瘤基因治疗的热点。人端粒酶有2个重要组成部分,人端粒酶RNA（humantelomeraseRNA,hTR）和人端粒酶反转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)。h

7、TR提供合成端粒DNA的模板,其中5′CUAACCCUAAC3′部分的作用更为关键[4]。本课题运用一种新的腺病毒载体构建方法,构建能表达针对hTR的模板部分基因的siRNA的腺病毒,并通过体外实验观察其抑制肿瘤细胞端粒酶活性和抗肿瘤的能力。　　1材料和方法　　1.1材料BDTMKnockoutAdenoviralRNAiSystem1购自BD公司,该试剂盒提供BamHⅠ/EcoRⅠ线性化的pSIRENShuttle,ICeuⅠ/PISceⅠ线性化的pAdenoX,siRNA阴性对照退火寡核苷酸等;限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Gene公司

8、;Lipofectin2000为Invitrogen产品;Reve