丹参多酚酸盐体外抗肿瘤作用及其机制的初步研究

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1、图4FCM周期分析，在1000ug／ml浓度时，亚G，峰为2．25，2．25％的细胞DNA降解，说明海藻消瘤口服液诱导细胞凋亡与Bax／Bcl一2Lk值升高，引起cytochromec表达增加和线粒体释放cytochromec激发下游的凋亡因子有关。以上结果推论出：海藻消瘤口服液诱导MCF-7细胞凋亡与升高Bax／Bcl-2比值，释放cytochromec凋亡调节信号通路有关。丹参多酚酸盐体外抗肿瘤作用及其机制的初步研究沈云婕“2，朱瑶卜，王松梅n，潘銮凤2(1．上海交通大学附属胸科医院药剂科，上海200030；2．复旦大学上海医学院分子生物学实验室，上

2、海200032)丹参多酚酸盐是由传统中药丹参中提取精制的水溶性多酚酸盐类化合物制备而成。丹参作为中医常用药物之一，有着悠久的临床应用历史。近年来对其主要活性部位水溶性成分的研究表明，丹参水溶性提取物具有改善微循环、抗血栓、促进组织恢复、抗脂质过氧化和清除自由基等广泛的药理作用12J。但对于丹参抗肿瘤作用的研究结果并不完全一致，有实验证实丹参对肿瘤细胞具有增殖抑制和细胞毒作用、诱导分化作用和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，但也有报道指出丹参促进肿瘤侵袋和转移的发生。这可能与药材本身复杂的成分、产地的差异和提取工艺等冈素有关系。本研究采用以丹参乙酸镁为质量控制标准、

3、有效成分明确的丹参多酚酸盐为原料，观察其对数种肿瘤细胞株体外增殖的影响及其可能的机制，为充分利用开发我国传统医药资源，寻找高效低毒的抗肿瘤成分提供参考。1．材料与方法1．1药物与试剂注射用丹参多酚酸盐，每瓶装200mg(含丹参乙酸镁160mg)，上海绿谷制药有限公司生产，以生理盐水溶解，过滤除菌，保存于4。C。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)、吖啶橙(Ao)、RNA酶A(RNaseA)均为Sigma公司产品；AnnexinV．FITC细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司；RPMI．1640培养基和胰蛋白酶购自Gibco公司；胎牛血清为

4、Hyclone公司产品。1．2细胞培养人肺腺癌细胞株SPC．A．1来自上海市胸科医院胸部肿瘤研究所；人肝癌细胞株SMMC．7721细胞、B淋巴瘤细胞株Raji细胞、急性粒细胞白血病细胞株HL．60细胞由复旦大学上海医学院分子生物学实验室保存。四种细胞均用含lO％胎牛血清、100U／ml青霉素、100U／ml链霉素的RPMI．1640培养液，于37℃、5％c02的细胞培养箱内传代培养。1．3细胞生长抑制．8l-1．3．1增殖抑制率将对数生长期的SMMC．772l、SPC．A．1、Raji及HL一60细胞，调整浓度为1X105个／ml，接种于96孔培养板中，

5、每孔100ul培养12h后，加入不同浓度的丹参多酚酸盐，每个浓度设4个平行孔，阴性对照组加入相同体积的生理盐水。以只含有不同浓度药物的培养液为空白。于37℃、5％C02培养箱中继续培养48h，每孔加入5mg／mlMTT20ul，作片j{4h后，离心弃去上清液，加入0．04N的盐酸异丙醇200I-tl，充分振荡，待孔内结晶溶解后，置于全自动酶标仪测定每孔570nm处的OD值，参考波长630nm。按下列公式求出肿瘤细胞生长抑制率(inhibitionrate，IR)：IR(％)=[1．(实验组OD值．空白对照组OD值)“阴性对照组OD值一空白对照组OD值)】

6、×100％。1．3．2生长曲线按上述MTT比色法，将SMMC．772l、SPC．A．1细胞接种下96孔板，用不同浓度的丹参多酚酸盐分别作用8h、24h、48h、72h后测其OD值，并以药物作用时间为横轴，OD值为纵轴，绘制生长曲线。1．4细胞形态学分析1．4．1吉姆萨染色取对数生长期的SMMC．7721细胞接种于预先置有盖玻片的培养皿中，12h贴壁后加入200lag／ml和500lag／ml的丹参多酚酸盐，对．}}《{组加入同体积的生理盐水，继续培养48h后吸去培养液，PBS漂洗，甲醇同定，吉姆萨(Giemsa)染色液孵育30min，冲洗，取出盖玻片，树

7、脂封片，光镜卜．观察。1．4．2荧光染色接种SMMC．772l细胞于培养皿中，加药并设立对照组同前，48h后终止培养，收集细胞，用PBS重悬细胞，制成105～106个／ml的单细胞悬液。吸出95ul细胞悬液，滴于载玻片上，加入5ulAO染液，混匀，压上盖玻片，立即荧光显微镜下观察细胞形态。1．5流式细胞仪检测1．5．1AnnexinV．FITC／PI双染分别收集不同浓度药物作用48h的SMMC．7721细胞l×106个／ml以上，PBS洗2次，按试剂盒说明书操作。流式细胞仪检测，激发波长488nm。1．5．2PI单染分别收集500lag／ml丹参多酚酸盐

8、作用8h、24h、48h、72h的SMMC．7721细胞及对照组细胞(同体积生理