携人il-12基因腺病毒的构建及其抗肿瘤机制的研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文携人IL--12基因腺病毒的构建及其抗肿瘤机制的研究姓名：成凤申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：涂植光201205重庆医科大学硕士研究生学位论文携人IL一12基因腺病毒的构建及其抗肿瘤机制的研究摘要目的：将腺病毒Ad5F35．GFP对4种不同细胞的转染效率与Ad5．GFP和pEGFP-N1进行比较，以获得腺病毒Ad5F35．GFP适用的细胞种类及各类细胞适用的转染方法。构建携带人白介素．12(IL．12)的重组腺病毒，观察其对H印3B增殖及TGF．p表达的影响。用携带IL广12的腺病毒感染单核细胞，观察在肿瘤

2、微环境下对肿瘤相关巨噬细胞形成的影响。方法：采用携有绿色荧光蛋白(greenfluorescemproteiIl，GFP)基因的腺病毒Ad5F35．GFP、腺病毒Ad5．GFP和质粒pEGFP-N13种载体，分别转染人慢性粒细胞白血病细胞系K562、人外周血单个核细胞、小鼠脂肪细胞株3T3．L1和小鼠肝癌细胞系HepA1．6。转染48h后，倒置荧光显微镜下观察GF．P的表达，肼PCR检测GFP的mRNA表达情况。PCR扩增IL．12基因，构建穿梭质粒pAdTrack．几．12；穿梭质粒经PmeI线性化后转化AdEasiercell，E．∞川BJ5

3、183内同源重组；PacI酶切重组腺病毒质粒，转染AD293，包装病毒；病毒pAd．IL．12感染肝癌细胞Hep3B，以ImPCR、W-estemblot检测白介素12的表达；MTT法检测肝癌细胞的增殖情况；RT-PCR检测转化生长因子．p(TGF—p)本研究受国家自然科学基金项目81172016资助。3重庆医科大学硕士研宄生学位论文的表达。以携带IL．12的腺病毒pAd．IL．12感染单核细胞，与Hep3B间接共培养，流式细胞术检测CD206的表达量，反映肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，仉气M)的形成情

4、况。。结果：Ad5F35．GFP转染K562、人外周血单核细胞效率较高，但不能有效地转染小鼠细胞；3种载体均不能有效地转染3T3．L1细胞；Ad5-GFP和pEGFP-Nl转染HepA1—6细胞效率都较高。XhoI、KpnI双酶切后琼脂糖凝胶电泳及测序表明，成功构建携IL．12基因的重组质粒，并成功包装了可高效感染Hep3B的腺病毒pAd．IL．12；ImPCR以及W．estemb10t结果表明，病毒pAd—m．12感染Hep3B后可高效表达白介素12，并且与对照组相比Hep3B增殖能力显著降低(P<0．05)，TGF．p表达量也降低(P

5、5)。pAd．几．12感染单核细胞组CD206的表达量低于空白组和空载组，说明T枷生成减少。结论：Ad5F35．GFP可高效转染人造血细胞和单核细胞，为相关研究及基因治疗奠定了基础。可高表达IL．12的腺病毒包装成功，感染肝癌细胞Hep3B后抑制其增殖，同时也下调TGF．p的表达；肿瘤环境中感染pAd．IL．12单核细胞吖M的形成减少。为进一步研究利用IL．12靶向逆转口蝴，防治肿瘤提供了基础。关键词：白介素12；转化生长因子．B；肿瘤相关巨噬细胞4重庆医科大学硕士研究生学位论文CONSTRUCTIONOFADENoVIRUSVECTORCONT

6、AININGHUMANIL．12GENEANDITSANTI．TUMORMECHANISMABSTRACTPurp髑e：T0conlparetheemciencyof3di舵rem仃ans凳ctionmethodsto4di能remcellsfordetermillingthesuitabletl伽fectionmethodf．0rw嵋iouScellS．T10coIls仃uctarecombimntadenoVi九JSexpressionveCtorc哪inghumanIL一12(hIL-12)gene，andinVestigateitse＆c

7、tsontheproli危rationandTGF-pexpressionofHep3Bcells．1’0血fectthemonocytesbyadenoViruscanyillgIL-12andobservethefomationoftumor-associatedmacropllages(删)i11thetumormicroenVironment．Methods：H啪anK562，hmlanmonocytes，mouSeadipocyte3T3．L1andmouseH印Al一6were仃ansfectedbyadenoVirusAd5-GFP

8、，Ad5F35．GFPandplasmidpEGFP-Nl(withLipof．ectaInille2000)，respectiVely