β内酰胺类抗生素对l1型金属β内酰胺酶的稳定性及酶动力学研究

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1、β内酰胺类抗生素对L1型金属β内酰胺酶的稳定性及酶动力学研究【关键词】β内酰胺类抗生素；L1型金属酶；稳定性；酶动力学ABSTRACTObjectiveToinvestigatethestabilityofβlactamstoL1metalloβlactamaseanditsenzymekiicparameters.MethodsTheL1fusionproteintherebinantE.coli.Thestabilityandkiicparametersof9βlactamstoL

2、1eter.ResultsRebinantL1shoilarhydrolyzingcapacitytopenicillinandcarbapenems,buthighlystableagainstaztreonamandceftazidime.ConclusionThestabilityandenzymekiicsof9βlactamstoL1metalloβlactamaseprovidedaguidelinefortheclinicaluseofantibiotics.KEYBL20［1］。

3、本实验中，将重组菌表达的L1融合蛋白进行纯化，并测定9种β内酰胺类抗生素对L1酶的稳定性及动力学参数，以了解L1型金属酶的酶学特性，现将结果报道如下。1材料与方法1.1药品与试剂青霉素G(penicillinG，PCG，华北制药集团)；头孢呋辛(cefuroxime，CXM，深圳制药厂)；头孢唑林(cefazolin，CEZ，西南药业股份有限公司)；头孢他啶(ceftazidime，CAZ，Glaxo公司)；亚胺培南/西司他丁(imipenem/cliastatin，IMP，美国MerckShar

4、pDohme药厂)；美罗培南(meropenem，MRP，日本住友制药株式会社)；氨曲南(aztreonam，AZ，上海施贵宝制药有限公司)；氨苄西林(ampicillin，ABPC，山东鲁抗医药有限公司)；头孢噻肟(cefotaxime，CTX，HoechstMarionRoussel公司)；Nitrocefin为英国Glaxo研究所产品。二甲基胂酸钠(sodiumcacodylate)为上海生工公司产品。1.2菌株产L1型金属酶的重组菌株MBL20。1.3仪器超声细胞破碎仪(宁波新芝仪器厂)；

5、5408R型台式高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；UV120型紫外分光光度计(日本岛津公司)；气浴恒温振荡器(EdmundBhler公司)。1.4L1融合蛋白的表达及纯化挑取含重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)单菌落接种于2ml含25mg/L卡那霉素的LB肉汤中，37℃过夜培养，然后按1∶100的比例转入新鲜LB肉汤，于37℃250r/min振荡培养至A600=0.6时，加入异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为1.0mmol/L。继续培养6h，菌液经10000r/min

6、离心30min，收集菌体，以NiNTA柱纯化表达蛋白。纯化产物经12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)证实。1.5确定各底物的最佳测定波长以50mmol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.0)配制9种β内酰胺类抗生素溶液，使药物终浓度为10-4mol/L。参照文献［2，3］，确定各底物的最佳测定波长分别为：青霉素G205nm，氨苄西林214nm，头孢唑林260nm，头孢呋辛265nm，头孢噻肟257nm，头孢他啶255nm，亚胺培南299nm，美罗培南299nm，氨曲南295nm

7、。1.69种抗生素对β内酰胺酶的稳定性测定取10-4mol/L底物2ml加酶液10μl，另取2ml底物加50mmol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.0)10μl，混匀后在37℃恒温水浴反应2h。以50mmol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.0)参比管为对照，在相应波长处测定加酶前各底物的A值，分别以缓冲液加酶液作对照，测定酶反应后底物的A值，根据反应前后A值变化，计算酶对各种底物的水解率：水解率=(底物A值-底物加酶后A值)底物A值×100%以青霉素G的水解率为100%，分别计算其它β内酰胺类抗生素

8、的相对水解率。酶稳定性实验均重复3次，以其A值之均数计算相对水解率［4］。1.7L1酶的米氏常数和最大反应速度［2～4］在25℃，pH7.0条件下将不同浓度的底物(2.5～100μmol/L)与酶立即混匀，在各底物最佳波长处进行时间扫描5min，绘制反应时间曲线。抗生素在酶水解作用下吸光度随时间下降，选择反应初始吸光度值下降和反应时间呈线性关系(即ΔA/Δt为恒定值)的区段，作为酶水解不同浓度底物的初速度V0。采用Line)、最大反应速度(Vmax)值和相对水解效率