β内酰胺类抗生素对l1型金属β内酰胺酶的稳定

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1、β内酰胺类抗生素对L1型金属β内酰胺酶的稳定【摘要】目的通过比较9种β内酰胺类抗生素对L1型金属β内酰胺酶(金属酶)的稳定性及酶动力学参数，了解金属酶L1的酶学特性。方法制备金属酶L1的纯化产物，以紫外分光光度计测定9种β内酰胺类抗生素对L1型金属酶的稳定性及酶动力学参数。结果重组L1酶水解青霉素及碳青霉烯类抗生素的能力接近，氨曲南及头孢他啶对L1酶高度稳定。结论L1酶的稳定性及动力学研究为指导临床合理应用抗生素提供了科学的理论依据。【关键词】β内酰胺类抗生素；L1型金属酶；稳定性；酶动力学ABSTRACTObjectiveToinvestigat

2、ethestabilityofβlactamstoL1metalloβlactamaseanditsenzymekiicparameters.MethodsTheL1fusionproteintherebinantE.coli.Thestabilityandkiicparametersof9βlactamstoL1eter.ResultsRebinantL1shoilarhydrolyzingcapacitytopenicillinandcarbapenems,buthighlystableagainstaztreonamandceftazidime.

3、ConclusionThestabilityandenzymekiicsof9βlactamstoL1metalloβlactamaseprovidedaguidelinefortheclinicaluseofantibiotics.KEYBL20［1］。本实验中，将重组菌表达的L1融合蛋白进行纯化，并测定9种β内酰胺类抗生素对L1酶的稳定性及动力学参数，以了解L1型金属酶的酶学特性，现将结果报道如下。1材料与方法1.1药品与试剂青霉素G(penicillinG，PCG，华北制药集团)；头孢呋辛(cefuroxime，CXM，深圳制药厂)；头孢唑林(ce

4、fazolin，CEZ，西南药业股份有限公司)；头孢他啶(ceftazidime，CAZ，Glaxo公司)；亚胺培南/西司他丁(imipenem/cliastatin，IMP，美国MerckSharpDohme药厂)；美罗培南(meropenem，MRP，日本住友制药株式会社)；氨曲南(aztreonam，AZ，上海施贵宝制药有限公司)；氨苄西林(ampicillin，ABPC，山东鲁抗医药有限公司)；头孢噻肟(cefotaxime，CTX，HoechstMarionRoussel公司)；Nitrocefin为英国Glaxo研究所产品。二甲基胂酸钠(sodi

5、umcacodylate)为上海生工公司产品。1.2菌株产L1型金属酶的重组菌株MBL20。1.3仪器超声细胞破碎仪(宁波新芝仪器厂)；5408R型台式高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；UV120型紫外分光光度计(日本岛津公司)；气浴恒温振荡器(EdmundBhler公司)。1.4L1融合蛋白的表达及纯化挑取含重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)单菌落接种于2ml含25mg/L卡那霉素的LB肉汤中，37℃过夜培养，然后按1∶100的比例转入新鲜LB肉汤，于37℃250r/min振荡培养至A600=0.6时，加入异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)

6、，使其终浓度为1.0mmol/L。继续培养6h，菌液经10000r/min离心30min，收集菌体，以NiNTA柱纯化表达蛋白。纯化产物经12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)证实。1.5确定各底物的最佳测定波长以50mmol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.0)配制9种β内酰胺类抗生素溶液，使药物终浓度为10-4mol/L。参照文献［2，3］，确定各底物的最佳测定波长分别为：青霉素G205nm，氨苄西林214nm，头孢唑林260nm，头孢呋辛265nm，头孢噻肟257nm，头孢他啶255nm，亚胺培南299nm，美罗培南299nm，氨曲

7、南295nm。1.69种抗生素对β内酰胺酶的稳定性测定取10-4mol/L底物2ml加酶液10μl，另取2ml底物加50mmol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.0)10μl，混匀后在37℃恒温水浴反应2h。以50mmol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.0)参比管为对照，在相应波长处测定加酶前各底物的A值，分别以缓冲液加酶液作对照，测定酶反应后底物的A值，根据反应前后A值变化，计算酶对各种底物的水解率：水解率=(底物A值-底物加酶后A值)底物A值×100%以青霉素G的水解率为100%，分别计算其它β内酰胺类抗生素的相对水解率。酶稳定性实验均重复3次，以其A值之均

8、数计算相对水解率［4］。1.7L1酶的