pla表位肽免疫微球诱导的ctl对肝癌细胞的杀伤作用

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1、PLA表位肽免疫微球诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤作用：陈玮　蔡美英　曹伟民　魏大鹏【摘要】　　目的考察载肽聚乳酸微球（PLA）体外诱导特异性CTL杀伤活性。方法采用标准51Cr释放法检测CTL杀伤活性。结果免疫微球M1、M2在体外均能刺激人PBMC增殖，形成大量可见克隆；CTL杀伤分析结果显示，免疫微球M1、M2诱导的效应细胞对荷肽T2细胞（T2+P）、HepG-2和Alexander的杀伤率均达75％以上，二者的杀伤活性没有明显差异（P＞0.05）。它们对表达hAFP的肝癌细胞HepG-2和Alexander的杀伤率均

2、显著高于不表达hAFP的膀胱癌细胞BTT和未荷肽的T2细胞，差异明显（P＜0.001）。结论免疫微球M1、M2均能在体外诱导产生特异性CTL，并对表达靶抗原的肿瘤细胞有较强杀伤作用。【关键词】聚乳酸微球；肝癌细胞；CTL表位；杀伤Abstract：ObjectiveTosurveythecytotoxicityoftheCTLinducedinvitrobyPLAmicrospherescontainingCTLepitopesderivedfromhAFP.MethodsThespecificcytolysisforh

3、epatocellularcarcinomacellethod.ResultsTicroparticles(M1、M2)containingCTLepitopesderivedfromhAFPinducedHLA-A2+PBMCfromhealthyvolunteertoproducecellproliferationandformabundantvisibleclones;ThecytolyticrateforhAFP+tumorcellsicroparticleshavepotentcapabilitytoinduc

4、especificCTLinvitroandkillhAFP+tumorcellseffectively.Keyicrosphere；hepatocellularcarcinomacell；CTLepitopes；cytotoxicity　　肝癌是严重威胁人类生命和健康的肝脏恶性肿瘤，临床治疗效果不理想［1］。长期以来，人们一直致力于肝癌免疫治疗的探索。目前，基于表位的肿瘤CTL疫苗设计已成为肿瘤免疫治疗研究的重要内容［2］。由于大多数人的肝癌细胞都有较高水平的甲胎蛋白（humanalpha-fetoprotein,hA

5、FP）表达，本研究以hAFP为靶抗原，采用可生物降解的有机高分子材料聚乳酸(polylacticacid,PLA)，制备PLA包封的CTL表位肽免疫微球，检测其体外诱导的特异性CTL对肝癌细胞的杀伤活性，为进一步研究其体内免疫效应和机制提供实验基础［3］。1材料与方法1.1材料和仪器HLA-A2限制的CTL表位hAFP158－166、hAFP218－226由本室确定，表位肽由西安美联公司合成、纯化、鉴定；聚乳酸（PLAMr75000～90000），中国科学院成都有机化学研究所曹伟民教授提供；Na251CrO4，Perki

6、nElmer，USA；RPMI-1640，GIBCO；新生小牛血清，兰州民海生物工程有限公司；淋巴分离液，上海试剂二厂；MTT，华美生物工程公司；18～25岁HLA-A2健康志愿者；肝癌细胞Alexander、HepG-2，膀胱癌细胞BTT，为本室冻存保种；T2细胞［4］由美国耶鲁大学医学院哈佛休斯医学研究所PeterCressray，USA；高速离心机，Beckman；UV-120紫外分光光度计，日本岛津；真空干燥机，浙江黄岩机械厂；γ计数器，国营二六二厂；DG-3022酶标仪，国营华光电子管厂。1.2方法1.2.1表

7、位肽hAFP158－166和hAFP218－226的合成与纯化鉴定表位肽委托西安美联公司采用固相合成法合成，合成所得粗产品经反相高效液相色谱纯化，冷冻干燥即得多肽纯品，并取样进行纯度分析和质谱鉴定。1.2.2荷肽PLA免疫微球的制备采用溶剂挥发法制备微球。表位肽hAFP158－166与hAFP218－226的包封方法相同。称取80mgPLA溶解于10ml二氯乙烷，加入0.2ml表位肽溶液（1mg/ml）,匀质器搅拌数秒，形成乳白色初乳，然后逐滴加入磁力搅拌下的20ml5％PVA溶液之中。6min后，再加入40ml蒸馏水，

8、继续搅拌，8h后离心洗涤3次，蒸馏水悬浮，测粒径。然后离心收集微球，部分做扫描电镜分析，其余冷冻干燥，辐照灭菌备用（四川省农科院生物核技术研究所进行）。1.2.3PLA免疫微球体外特性检测载药量和包封率的测定取20mg微球溶解于2ml氯仿之中，完全溶解后，加PBS，漩涡混合器上充分混合后静置，使油、水相分离。收集水相