筛选CD147 CTL表位肽并诱导特异性CTL用于抗耐药肿瘤研究

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1、广东药科大学硕士研究生毕业论文分类号：___________密级：__________UDC：___________筛选CD147CTL表位肽并诱导特异性CTL用于抗耐药肿瘤研究姓名：瞿创学号：2111540066院系：药学院学位类型：学术学位专业：微生物与生化药学研究方向：肿瘤免疫治疗导师：沈晗副教授论文提交日期：2018年3月20日论文答辩日期：2018年5月18日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年五月广东药科大学硕士研究生毕业论文IdentificationofCD147CTLepitopeandinducespecific

2、CTLsforuseinanti-drugresistanttumorsCandidate：ChuangQuStudentID：2111540066Affiliation：SchoolofpharmacyAcademicDegreeApliedfor：DegreeofMedicineSpeciality：MicrobiologyandBiochemistryPharmacySupervisor：AssociateProf.HanShenAssistantSupervisor：Prof.HongWeiShaoDayofDefence：

3、May2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPharmaceuticalUniversityMarch2018广东药科大学硕士研究生毕业论文摘要目的：通过研究CD147在耐药肿瘤细胞中的作用，然后确定以CD147作为靶点，筛选CD147用于过继性细胞免疫治疗CTL的抗原表位，对野生型抗原表位进行改造，并在体外诱导出抗原特异性CTL，鉴定出具有抗耐药肿瘤功能的CTL抗原表位。为今后肿瘤相关抗原特异性T细胞过继性免疫治疗提供新的方法和靶点，也进一步为开发以CD147为靶点的TCR基因治疗药

4、物提供一定的参考价值。方法：一、利用CRISPR敲除技术构建PX458-CD147敲除质粒，MTT法检测MCF-7/Adr敲除CD147前后耐药性以及IC50的变化，来研究CD147是否参与耐药肿瘤细胞耐药性的形成。二、利用经典的CTL表位在线预测系统BIMAS和SYFPEITHI对CD147蛋白序列进行CTL表位预测评分，寻找到与MHC分子低亲和力的野生型HLA-A2限制性9个氨基酸的抗原表位CD147126-134，对该9肽2位锚定残基进行点突变设计，通过对比突变前后的在线预测评分，筛选具有较高预测评分的突变肽，随后用T2细胞进

5、行肽亲和力实验和MHC肽结合稳定性实验验证预测结果。三、用正常人PBMC，获取单核细胞并在体外刺激诱导出成熟的DC细胞，并用成熟的DC细胞体外分别负载野生型表位肽CD147126-134和突变肽CD147126-134L2体外与PBMC共培养刺激诱导出CTL。再用IFN-γELISpot和钙黄绿素法验证CTL对负载肽的T2靶细胞的识别，然后再用钙黄绿素释放实验检测CTL对四种不同的肿瘤细+high++low+-+胞MCF-7/Adr（A2，CD147）、MCF-7（A2,CD147）、Hela（A2,CD147）、+-SKOV3（A

6、2，CD147）的细胞毒作用，最后用HLA-A2抗体阻断实验来验证CTL对靶细胞的杀伤作用是否是以HLA-A2限制性的方式进行。四、提取实验组RNA，采用多重PCR技术进行多重基因分析方法并结合毛细管电泳检测CD147126-134L2表位肽刺激前后T细胞抗原受体（TCR）Vα和Vβ亚家族表达情况，研究抗原肽诱导的CTL中能识别突变肽CD147126-134L2抗原特异性T细胞的克隆增殖情况。结果：1广东药科大学硕士研究生毕业论文MCF-7/Adr耐药株用CRISPR技术敲除CD147后，相比于敲除前，耐药性显著降低；筛选到的野生型

7、CD147126-134表位肽2位由突变为Leu后得到突变肽CD147126-134L2，并且突变肽CD147126-134L2与HLA-A2的亲和力和稳定性显著提高；IFN-γELISpot实验表明，突变肽CD147126-134L2诱导的CTLs不仅能够有效识别负载了突变肽CD147126-134L2的T2靶细胞，并且对负载了野生型肽CD147126-134的T2靶细胞同样具有相似的杀伤效果，表现出一定的交叉识别效应。钙黄绿素法检测CTLs对T2靶细胞的细胞毒作用可以看出，随着效靶比的逐渐递增，突变肽CD147126-134L2

8、诱导的CTLs显示出了对负载了肽的T2靶细胞有效识别以及杀伤作用；通过CTLs对肿瘤细胞的杀伤结果来看，突变肽CD147126-134L2诱导的CTLs特异性识别CD147表达的肿瘤细胞，并且这种杀伤效果对高表达CD147的MCF-7