k562细胞外泌体诱导特异性ctl生成的研究论文

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1、K562细胞外泌体诱导特异性CTL生成的研究论文陈绍倩，杜英，王鑫，顾巧丽，黄玉敏，董子明【摘要】为了研究人白血病细胞株K562细胞分泌的外泌体(exosomes)及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞（DC）分泌的外泌体能否诱导出K562细胞特异性CTL，采用四步离心法提取K562细胞及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞的培养上清液中的外泌体，并诱导CTL生成.freelesDerivedfromK562CellsAbstractTheaimofthisstudyesderivedfromK562cellsandhumanmo

2、nocyte-deriveddendriticcells(DCs)transfectedphocytes(CTL)responsesinvitro.DCsperipheralbloodmononuclearcells(PBMNC)ofhealthyvolunteersinthepresenceofGM-CSFandIL-4,andthenesthesupernatantofDCsandK562cells.TheTcellorspecificCTLafterDCsandexosomeshealthyvolunteers′PBMNC.

3、TheeffectofCTLonK562cellsentofTcellsesderivedfromK562cellsorDCstransfectedotetheirkillingabilityonK562cellsasparedesonK562cellsmuneresponsetoleukemiacellscanbeinducedbyexosomesderivedfromK562cells.Keye；cytotoxicTlymphocyte外泌体（exosome）是一种直径在50-90nm的亚细胞双层膜颗粒,抗原呈递细胞衍生的外泌

4、体携带有丰富的抗原呈递所需要的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、共刺激分子和热休克蛋白等分子；肿瘤细胞衍生的外泌体还携带有肿瘤相关抗原，能诱导肿瘤相关抗原的特异性CTL反应，是一种有效的抗原转运呈递载体［1,2］。Zitvogel等［3］的动物体内实验结果显示，用实体肿瘤抗原冲击树突状细胞（DC），其外泌体可以诱发荷瘤小鼠的肿瘤排斥效应。Morse等［4］的一期临床实验用非小细胞肺癌MAGE-A3或A4抗原冲击进展期非小细胞肺癌患者(MAGE抗原阳性)自体树突状细胞，获得DC衍生的外泌体，这种携带MAGE肿瘤抗原的DC衍生的外泌体可以诱导M

5、AGE特异性T细胞反应并使一部分病人的病情得到缓解和控制，提示DC衍生的外泌体可以作为无细胞治疗性肿瘤疫苗用于肿瘤的免疫治疗。外泌体在实体肿瘤方面的研究报告较多，而在白血病方面的报告却甚少，因此我们提取了白血病细胞株K562细胞及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞的外泌体，观察了其诱导的抗白血病细胞的作用，发现其外泌体能诱导K562细胞特异性CTL，现报告如下。材料和方法主要试剂标准胎牛血清、淋巴细胞分离液(TBD公司产品);rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2(Peprotech公司产品)；完全培养基RPMI1640（

6、Gibco公司产品）;小鼠抗人MHC-I、MHC-II、CD54（ICAM-I）、CD86（B7-2）、CD80（B7-1）、CD40单克隆抗体（Ancell公司产品）；胶体金标记马抗小鼠IgG(华美公司产品)。二甲亚砜、四甲基偶氮唑蓝(Sigma公司产品)；TRIzoL试剂(Invitrogen公司产品)；DOTAP脂质体（Roche公司）。细胞株培养K562细胞株和HL-60细胞株系郑州大学基础医学院保存株。K562和HL-60细胞于含10%的胎牛血清(56℃灭活30分钟)、1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素、5×1

7、0-5mol/L2-巯基乙醇和1×10-3mol/L谷氨酰胺的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养。K562细胞总RNA制备按照TRIzoL试剂说明书抽提处于对数生长期的K562细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，紫外分光光度仪测定A260和A280数值。DC的诱导和培养从正常人外周全血细胞获得贴壁细胞，调整浓度至5×105/ml，悬浮培养于RPMI1640完全培养液中，分别加入终浓度为100ng/mlrhGM-CSF和500U/mlrhIL-4,隔天半量换液，补充新鲜培养液及细胞因子以诱导生成DC

8、。取上述制备的K562细胞总RNA(25μl/250μlOpti-MEM)和DOTAP(50μl/250μlOpti-MEM)各250ml，室温下在聚苯乙烯试管中混合20分钟,混合物加入培养5天的DC，在37℃培养箱孵育4小时。4小时后吸出培养上清