胶质瘤来源的exosome冲击树突状细胞体外诱导特异性ctl的初步研究

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1、河北医科大学硕士学位论文胶质瘤来源的Exosome冲击树突状细胞体外诱导特异性CTL的初步研究姓名：李建良申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：焦保华201203中文摘要胶质瘤来源的Exosome冲击树突状细胞体外诱导特异性CTL的初步研究摘要目的：旨在证实胶质瘤原代细胞可以分离出外来体，从外周血诱导分离能够培养出树突状细胞，将胶质瘤细胞培养液分离出的外来体致敏树突状细胞，观察其体外所引起的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。方法：选取临床上高度恶性胶质瘤标本，制作成单个胶质瘤细胞悬浮液，将悬浮液分成两份，取其中一份进行原代细胞培养，收集培养两周的细胞培养液，采用

2、差速离心法分离出胶质瘤细胞所分泌的外来体；取另一份胶质瘤单个细胞悬浮液，通过反复离心和冻融的方法制备出胶质瘤冷冻抗原；采取同一患者外周血，利用淋巴细胞裂解液并采用离心的方法，从外周血中获取单核细胞,UT淋巴细胞，其中这些单核细胞在细胞因子IL一4、GM．CSF作用下进行培养，使其转变成为不成熟的树突状细胞，然后添加细胞因子TNF—Q继续培养，使其变为成熟的树突状细胞；将胶质瘤来源的外来体、胶质瘤冷冻抗原分别冲击树突状细胞并与T淋巴细胞共同培养，通过MTT法检测两种免疫方法体外对胶质瘤细胞的杀伤效应，并对所得结果采用SPSS16．0进行统计学分析。结果：胶质瘤细胞原代培

3、养过程中，在倒置相差显微镜下观察生长良好，贴壁细胞成长梭状，大小均匀、形态单一，呈弥漫型分布；exosome在透射电镜下观察，可以看到多个呈类圆盘状、大小不等的半球体，直径大小约40～100nm，该半球体由脂质双层膜包绕，外层的脂质双分子层染色较深，内部为均匀的淡然区域；通过观察发现，单核细胞培养2～4个小时成贴壁状态，此时单核细胞体积较小、呈较光滑的圆形。继续进行培养，2～3天时细胞的形状发生变化，由以前的圆形逐渐变成无规则形状，体积较以前变大，表面出现一些较小的突起(Fig4)。第5天时，细胞呈簇状分布同时伸出许多较大的树突状突起，体积较以前更大，另外还可以观察到

4、有少量的悬浮细胞(Fig5)。向树突状细胞培养液中分别加入exosome或胶质瘤冷冻抗原，共养到第7天时，加入细胞因子TNF。Q继续培养24d"时，此时大部分细胞呈悬浮状态，细胞表面伸出大量树突状突起，为典型的树中文摘要突状细胞形状；当效靶比为10：1、25：1、50：l情况时，冷冻抗原．DC+T细胞对恶性胶质瘤细胞杀伤率分别是17．50％±1．13％、21．18％±1．36％、30．20％±1．46％。Exosome．DC+T细胞组对恶性胶质瘤细胞杀伤率(％)分别是32．25％±1．36％、43．04％±1．22％、70．42％±1．40％。两组进行对比可以发现存在

5、显著性差p<0．05)。结论：胶质瘤细胞原代培养液经过差速离心的方法，可以分离出外来体，这种外来体具有很好的免疫活性。利用淋巴细胞裂解液并采用离心方法，可以在外周血中获取大量单核细胞glT淋巴细胞，这些单核细胞在细胞因子IL．4、GM．CSF和TNF．Ct的作用下，最终转变为成熟的树突状细胞。将胶质瘤细胞来源的外来体致敏树突状细胞后，它可以激活细胞毒性T淋巴细胞反应，从而特异性杀伤胶质瘤细胞，并且其特异性杀伤胶质瘤细胞能力，明显优于胶质瘤冷冻抗原致敏树突状细胞所产生的细胞毒效应。关键词：外来体：胶质瘤；树突状细胞：杀伤效应：细胞毒性T淋巴细胞；差速离心法英文摘要Pre

6、liminarystudyofcytotoxicTlymphocytes(CTLs)bydendriticcells(DCs)pulsedwithexosomesderivedfromgliomacellsABSTRACTObjective：Designedtoconformthegliomaprimarycellscanbeisolatedexosomes．Wecanisolatemononuclearcellsfromperipheralblood，thenWhichcanbeconvertedintodendriticcellsthroughthedevelop

7、menteventually．AfterDCarepulsedwithexosomesderiverdfromgliomacells．theyareabletocausetheactivationeffectoncytotoxicTlymphocytes．Methods：Selectedahighlymalignantgliomaspecimensfromclinicalandmadeitintoasinglegliomacellsuspension．ThesuspensionwasdividedIntotwo，oneofthemwasusedfor