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1、评估重组BCG对EBV阳性肿瘤细胞的作用 EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)是具有B淋巴细胞嗜性的疱疹病毒,属疱疹病毒科γ亚科,是重要的DNA致瘤病毒。第一次EB病毒感染大多发生在儿童时期,感染者无明显临床症状,人一旦被感染将终身带毒。在一生的任何时期体内病毒若被活化,这种病毒就可能转变为能引起肿瘤等诸多疾病的病因。研究发现,EB病毒与许多人类恶性肿瘤相关,包括胃癌、霍奇金淋巴瘤、Burkitt's淋巴瘤、鼻咽癌(NPC)等。 本实验拟将文献构建的EB病毒融合基因重组BCG分泌型表达质粒pMV261进行体外及体内的免疫学检
2、测,评估重组BCG对EBV阳性肿瘤细胞的作用,为应用重组BCG特异性杀伤EBV阳性肿瘤细胞提供理论依据和技术支持。 材料与方法 1材料 卡介苗(BCG)分泌型表达质粒pMV261为Sto-ver博士构建;EB融合基因Z2A(膜蛋白基因LMP2A与即可早期基因BZLF1融合基因)由朱伟博士构建;EB病毒阳性胃癌细胞GT39由罗兵教授馈赠。乳酸脱氢酶底物溶液购于德国Roche公司;非放射性CTL杀伤活性检测试剂盒、DNA连接酶、DNA聚合酶购于美国Promega公司;EcoRⅠ、DNAMarker、BamHⅠ、SalⅠ为博亚公司产品;T4DNA连接酶、Taq酶
3、及各种限制性内切酶为日本TaKaRa公司产品。 2方法 2.1Z2A基因的表达及目的蛋白检测将重组BCG和普通BCG接种于米氏培养液中,在37℃下振荡培养,测定不同培养时间的吸光度(A550)值。BCG培养至对数生长期,迅速转到45℃摇床培养,3h后收集菌体,磨砂破碎(加溶菌酶),以3500r/min(离心半径10cm)离心10min,取上清液,用半透膜浓缩,进行8%SDS-PAGE电泳。取出凝胶,测定蛋白分子质量后电转移至PVDF膜,PVDF膜用封闭液封闭后进行P2A抗体,二抗为HRP标记物。加入ECL显色系统显示,暗室内加X-光片曝光,观察结果。 2.
4、2小鼠免疫与血清抗体检测将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为2个免疫组和2个对照组(BCG对照组和PBS对照组),每组5只,每周免疫1次,共3次,间隔3周。其中第1组注射5108个重组BCG数(100μl)/只,第2组注射重组BCG5107个(100μl)/只,第3组注射未重组外源片段的BCG1108个(100μl)/只,第4组注射无菌PBS100μl/只。 免疫前、加强免疫前及末次免疫后每2周小鼠尾部采血,直至免疫后第21周为止。分离血清,采用ELISA检测特异抗体。包被抗原为LMP2A,每孔0.8μg。底物为四甲基联苯胺(3,3p
5、,5,5p-Tetramethylbenzi-dine,TMB)。用酶标仪测定各孔吸光度(A550)值。 2.3细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应(乳酸脱氢酶法)将重组BCG和普通BCG接种于米氏培养液中,在37℃下振荡培养,测定不同时间的吸光度(A550)值。 BCG培养至生长中期,迅速转到45℃摇床培养。在超净工作台过滤去除培养基,PBS冲洗2次,收集菌体,用PBS稀释成细胞数为5108个/100μl,皮下注射免疫6~8周小鼠,试验设PBS作对照。第3、5周各加强免疫1次,共免疫3次。7周后杀死小鼠,取脾,制备淋巴细胞悬液,检测CTL对EB病毒阳性胃癌细胞
6、GT39的杀伤率。 2.4统计学方法各组数据均以x±s表示,采用SPSS10.0统计软件作t检验。以P<0.05差异有统计学意义。 结果 1Z2A基因的表达及目的蛋白的检测 重组BCG用米氏培养基培养后进行破菌,纯化的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后转膜,进行P2A。 2重组BCG免疫小鼠血清抗体水平 分别用重组BCG5108个/只和5107个/只注射免疫小鼠,采用ELISA方法检定血清抗体水平,结果见图2。第一次免疫后2周,高剂量重组RCG免疫组小鼠血清抗体滴度为7600(71.6±8.2)pg/ml,低剂量组为5
7、400(54.5±6.2)pg/ml,对照BCG及PBS对照株接近于0。随着免疫时间的延长,重组BCG组刺激机体产生的抗体增长较快,至免疫后第6周,高剂量组抗体滴度达17600(186.5±6.7)pg/ml,低剂量组为13500(136±6.2)pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。 3免疫小鼠的CTL反应 试验分重组BCG组、BCG对照组和PBS对照组,每组5只小鼠。CTL反应结果见图3,重组BCG感染能激发小鼠脾脏CTL反应,其中BCG对照组及PBS对照组对GT39细胞的杀伤率分别为(32.5&p
