immunoaif△1480融合蛋白对her2阳性肿瘤细胞的杀伤作用

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1、ImmunoAIF△1480融合蛋白对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用：韩涛,张勇,孙书明,任君琳,李伟,郭张燕,孟艳玲,杨安钢【摘要】目的:观察免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1480对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用。方法:利用PCR的方法将九聚精氨酸编码序列(R9)与AIFC末端结构域编码区重组,然后将R9AIF△1480基因与pCMVe23sFv载体重组,构建免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1480真核表达载体。用脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,建立稳定转染的细胞株,通过RTPCR、)等方法检

2、测重组基因在转染细胞中的表达及其对HER2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤活性。结果:经过酶切鉴定与测序证实,带有ImmunoAIF△1480基因的真核表达载体构建成功,经RTPCR、检测发现融合蛋白ImmunoAIF△1480对HER2阳性肿瘤细胞SGC7901和SKBR3有明显的促凋亡活性,而对不表达HER2分子的ECV304细胞几乎没有影响。结论:ImmunoAIF△1480可以特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞。【关键词】凋亡诱导因子;HER2阳性肿瘤细胞;细胞凋亡凋亡诱导因子（apoptosisinducing

3、factor,AIF）是1996年发现的一种凋亡诱导蛋白,全长为613个氨基酸,成熟的AIF分子长为559个氨基酸,由3部分构成:1个FAD结合结构域（122262aa和400477aa）,1个NADH结合结构域（263399aa）和1个C末端结构域（481610aa）。AIF是一种双功能分子,N末端的FAD结合结构域及NADH结合结构域发挥着氧化还原酶的作用,而分子C末端结构域具有促凋亡活性。AIF在细胞中表达后定位于线粒体膜间隙中［1］,当凋亡信号刺激时,可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质,然后转位到细胞

4、核内,直接介导细胞核发生凋亡［2-4］。之后,研究人员在细胞中又发现了AIF的另一种亚型AIFsh(353613aa),该亚型与AIF具有相似的促凋亡功能［5］。鉴于AIF在细胞凋亡中具有的独特功能,我们拟进一步探索其在基因治疗中应用的可能性。在成功克隆AIF△1120基因的基础上［6］,我室刘湘丽等［7］对AIF基因的结构进行了进一步截短,构建了仅保留AIF分子C端(481613位aa)的AIF△1480基因,并证明AIF△1480基因仍具有促凋亡活性,说明AIF分子的氧化还原酶活性与促凋亡活性可以分离而不受影响

5、。在本实验中,我们将AIF△1480基因与具有转膜作用的九聚精氨酸（R9）基因及识别HER2抗原的单链抗体e23sFv基因重组,构建了免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1480基因表达载体,观察表达的免疫促凋亡分子对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用。1材料和方法1.1材料pcDNA3e23sFvPEⅡAIF△1120(ImmunoAIF△1120)质粒由第四军医大学免疫学教研室(本室)构建,载体pCMVe23sFv由杨安钢教授构建。E.coliDH5α菌种、中国仓鼠CHO细胞系、SGC7901细胞系、ECV

6、304细胞系、SKBR3细胞系为本室保存和培养。载体pCMV4由本室保存,TaqDNA聚合酶、DNA限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司、新生牛血清购自杭州四季青生物公司。RPMI1640培养基及脂质体LipofectAMIM2000购自Invitrogen公司。山羊抗人AIF多克隆抗体购自SantaCruz公司。HRP标记兔抗山羊二抗购自中杉公司。1.2方法1.2.1引物设计根据AIF的基因序列设计引物为H2(5′TTTGCGGCCGCGAAAAGACGGAGGAGACGCAGGCGGAGAAGGAT

7、GTTCTGGAGTGAT3′)和zy2（5′TTTTCTAGAGTCGACTCAGTCTTCATGAATGTTGAATAG3′）。1.2.2pCMVe23sFvR9AIF△1480真核表达载体的构建以质粒pcDNA3AIF△1120为模板,用H2和zy2进行PCR,扩增出带有R9的AIF△1480基因。用NotⅠ和XbaⅠ分别双酶切pCMVe23sFv与R9AIF△1480,胶回收,T4DNA连接酶连接,并转化E.coliDH5α菌株,挑克隆,提取质粒,酶切鉴定,鉴定正确的克隆由北京奥科公司测序,

8、将测序正确的质粒命名为ImmunoAIF△1480。1.2.3细胞转染和稳定建系于细胞转染前24h,用胰酶消化生长至对数期的CHO细胞,置于细胞培养瓶中培养,待细胞达80%汇合率时进行转染细胞。先用无血清RPMI1640液洗2次,加500μL无血清RPMI1640,分别将8μgImmun