lmp1基因沉默对ebv阳性上皮细胞凋亡和增殖影响论文

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1、LMP1基因沉默对EBV阳性上皮细胞凋亡和增殖影响论文冯艺王笑峰王云罗兵【摘要】目的探讨化学合成小干涉RNA（siRNA）对EpsteinBarr病毒（EBV）潜伏膜蛋白1（LMP1）阳性胃上皮（GT38）细胞LMP1编码基因表达的抑制作用，以及对细胞增殖和凋亡的影响。方法化学合成靶向LMP1mRNA不同位点的3对siRNA，分别转染GT38细胞，选择干扰效果最佳的siRNA进行实验研究，行RTPCR、Hochest33258荧光染色及流式细胞术分析。结果RTPCR结果显示，3对靶向LMP1的siRNA均能抑制GT38细胞LMP1的转录表达，

2、以靶向LMP1mRNA649位点的siRNA作用效果最强。Hochest33258荧光染色可见siRNA649作用后的GT38细胞发生凋亡。流式细胞分析显示，siRNA649作用24、72以及120h后的细胞其细胞周期无明显改变。RTPCR检测结果表明.freelembraneprotein1(LMP1)codinggeneontheproliferationandapoptosisofEBVpositivegastricepitheliumcells.MethodsThechemicallysyntheticsiRNAtargetingLMP1

3、etryarkedlyinhibitedtheexpressionofLMP1intargetcells,andtheeffectofsiRNA649ostobvious.ApoptosisetryanalysisshoicallysyntheticsiRNAtargetingLMP1genecouldeffectivelysilencetheexpressionofLMP1.ThenitmaythoughsuppressingtheexpressionofBcl2leadtargetcellsapoptosis.Thiscelllinecanb

4、eusedasagoodtargetcelltoexploreLMP1bioactivityanditseffectinoncogenesisofEBVcorrelatedtumors.［KEYP1）编码基因已被确认具有癌基因的功能2。近年来的研究结果表明，LMP1具有介导细胞增殖、抑制细胞凋亡的功能；LMP1表达还可抑制细胞分化，与鼻咽癌的低分化有关，并能促进肿瘤的侵袭和转移3～6。小干涉RNA（siRNA）能高效、特异地阻断体内特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因缺失表型。本研究选择EBV阳性胃上皮（GT38）细胞作为靶细胞，采用人工合成的s

5、iRNA特异性阻断LMP1的表达，检测LMP1沉默对GT38增殖和凋亡的影响，旨在探讨LMP1在EBV相关肿瘤发生发展中的分子机制，为EBV相关肿瘤的生物治疗提供实验依据。1材料和方法1.1实验材料1.1.1主要试剂DMEM培养基、胎牛血清以及OPTIMEMI培养基均购自美国GIBco公司。LipofectamineTM2000和TRIzol均购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自美国Promega公司。碘化丙啶(PI)、Hochest33258购自美国Sigma公司。1.1.2靶细胞EBV阳性GT38细胞由日本鸟取大学医学部生体情报学教

6、室西连寺刚教授惠赠，用作该实验的靶细胞。1.2实验方法1.2.1靶向LMP1基因寡核苷酸的设计本文靶向LMP1基因的siRNA、荧光标记的siRNA（FAMsiRNA）以及非特异性siRNA，均由广州锐博生物科技有限公司合成。经过Blast确定靶向LMP1基因siRNA的特异性及非特异性siRNA与人的mRNA无同源性。序列见表1。表1siRNA序列货号LMP1靶向位点（略）1.2.2siRNA转染效率的检测将GT38细胞接种于24孔细胞培养板中，待细胞生长至30％～50％汇合时，采用脂质体法分别以20、30、50、80和100nmol/L终浓度

7、的FAMsiRNA在OPTIMEMI培养基中转染细胞，在37℃，体积分数0.05的CO2培养箱中培养6～8h后，更换为含体积分数为0.10的胎牛血清不含双抗的培养基。转染12h内用倒置荧光显微镜检测转染效率，转染效率=荧光细胞的数量/相同视野下的细胞总数×100％。靶向LMP1的siRNA和非特异siRNA的转染方法与FAMsiRNA的转染方法相同。1.2.3半定量RTPCR检测LMP1、Bcl2、BaxmRNA转录水平将特异性siRNA以50nmol/L终浓度分别转染GT38细胞，分别于转染后24、48和72h收集细胞，TRIzol一步

8、法提取细胞总RNA。按照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cDNA用作PCR模板。扩增LMP1、Bcl2、Bax基因和内参照