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1、鼻咽癌细胞侵袭中DACT1基因甲基化的作用 最近研究发现,DACT1（Dapper1/Dpr1）基因是一个肿瘤相关基因,其在调节肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭及转移中起重要作用。有研究提示,在非小细胞肺癌中DACT1的表达与肿瘤病理分级、大小、侵袭及转移有关。鼻咽癌中DACT1的表达情况及其与鼻咽癌的发生、发展及转移的关系还未见报道。本研究将通过改变DACT1甲基化状态改变其表达情况,观察DACT1基因在鼻咽癌细胞侵袭中的作用。 1材料与方法 1.1细胞培养E2细胞购于中国生命科学院上海细胞所,在5%二氧化碳、37℃的条件下,用含10%胎牛血清的1640培养基培养
2、。在细胞处于对数生长期时用胰蛋白酶消化后分离E2细胞,然后以等量接种在六孔板上,第2天,将六孔板中的6孔随机分为两组,一组用S-腺苷-L-甲硫氨酸处置,另一组不加任何药物,药物作用1d后更换培养基继续培养,2d后收获细胞用于后续实验。 1.2甲基化特异性PCR上述细胞收获后用DNA提取试剂盒提取各组细胞的DNA,然后用DNA甲基化试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰,根据GeneBank中DACT1基因序列用甲基化引物设计软件分别设计甲基化和非甲基化引物序列。甲基化引物序列（M）:5-CGGGATAGTAGTAGTCGGC-3（S），5-CGCTAAAACTACGACCGCG
3、-3（R），非甲基化引物（U）：5-GTTGGGATAGTAGTAGTTGGT-3（S），5-AAACACTAAAACTACAACCACA-3.分别用两种引物对上述亚硫酸盐修饰的各组细胞的DNA进行扩增,退火温度分别是60℃（甲基化）和58℃（非甲基化）。分别取PCR产物10μl用2%琼脂糖凝胶电泳,观察DACT1基因甲基化情况。 1.3RT-PCR采用TRIzol试剂提取上述细胞的总RNA,用逆转录酶进行反转录形成DNA第一链（cDNA）。根据GeneBank中基因序列分别设计DACT1和β-actin两对引物,分别以cDNA为模板行PCR.DA
4、CT1引物:5-GGAAGAGGACAGGCTTGGAAAC-3（S），5-GTCCCATTGTTCAGAGAAGGTATC-3（R）；β-actin引物：5-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3,5-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3,退火温度均是60℃。反应结束后取PCR产物5μl用1.5%琼脂糖凝胶电泳,观察DACT1表达情况。 1.4细胞侵袭实验（transl悬液,取1ml细胞悬液于1500rpm离心5min,弃上清。加入200μl无血清培养基,吹打均匀后放入transu;l含10%FBS1640
5、的完全培养基,将小室放入板中。37℃下于5%CO2培养箱中培养24h.将小室取出,用PBS洗去培养基,结晶紫染色10min,自来水将表面的结晶紫洗除干净,用棉签将上室中的细胞擦除干净,于倒置显微镜下观察,每组细胞随机取10个视野记录细胞数,分析观察两组细胞侵袭能力。 1.5统计学方法采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x-±s）表示,采用t检验；计数资料以率（%）表示,采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。 2结果 甲基化特异性PCR结果显示,未经S-腺苷-L-甲硫氨酸
6、处理的E2细胞中DACT1基因是非甲基化的，而经过S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的E2细胞中DACT1基因是甲基化的,这说明S-腺苷-L-甲硫氨酸能使非甲基化的DACT1基因重新甲基化。 RT-PCR结果提示,在未经S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的E2细胞中DACT1高表达,而在经过S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的E2细胞中DACT1不表达,这说明S-腺苷-L-甲硫氨酸通过改变DACT1基因的甲基化状态而改变了其表达。 transn;2.15）明显多于经过S-腺苷-L-甲硫氨酸处理的E2细胞侵袭数（χ2=8.50±1.08,t=5.868,P<0
7、.001）。这说明DACT1的表达情况影响E2细胞的侵袭能力。 3讨论 DACT1基因定位于14q22.3,其编码836个氨基酸的蛋白质,氨基端有1个亮氨酸连接区域,羧基端有1个PDZ连接位点。最近研究发现,其是1个肿瘤相关基因,其可能通过增强Bata-连环蛋白的表达,影响aC,etal.OncogenicFunctionofDACT1inColonCancerthroughtheRegulationofb-catenin.PlosOne,2012,7（3）：1-17. [2]Kongethylation-associatedsilencingofthed
