Notch1基因在调控人肝癌细胞HepG2侵袭转移中的作用.pdf

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1、山东医药2014年第54卷第25期·基础研究·Notchl基因在调控人肝癌细胞HepG2侵袭转移中的作用毛静芳，周建中，周家华(1江苏联合职业技术学院南通卫生分院外科教研室，江苏南通226007；2东南大学附属中大医院)摘要：目的探讨Notchl基因在调控人肝癌细胞HepG2侵袭转移中的作用。方法将Notchl细胞内段(pc．NICD)、干扰RNA和pEGF—CI空载体转入到HepG2细胞中，筛选稳定表达的细胞，采用荧光显微镜、RT—PCR及Westernblot检测NotchlmRNA及蛋白；采用Transwell迁移及Matrigel

2、侵袭实验鉴定HepG2细胞侵袭、迁移能力。结果上调Notch1受体表达，可使肝癌细胞HepG2迁移侵袭能力增强；反之，下调Notchl受体表达时，细胞迁移侵袭能力减弱(P均<0．05)。结论Notchl基因对肝癌细胞HepG2的侵袭、转移具有重要作用。关键词：肝肿瘤；Notchl；侵袭；转移cloi：10．3969／j．issn．1002-266X．2014．25．010中图分类号：R735．7文献标志码：A文章编号：1002-266X(2014)25-0024-03肝癌是临床常见恶性肿瘤之一，以手术为主的变性裂解液，吹打混匀后，按说明书

3、操作提取总综合治疗效果一般。因此，加强对肝癌发病过程中RNA。将提取的1～2IxgRNA按逆转录试剂盒说分子机制的研究有重要意义。研究表明，Notch信明书逆转录成cDNA，一20clC保存备用。Notchl上号通路在实体瘤中起癌基因或抑癌基因的作游弓I物：5一TrACAGCCACCATCACAGCCACACC一3，用-3]。2011年1月一2013年l2月，我们通过调下游弓I物：5一ATGCCCTCGGACCAATCAGA一3，PCR节Notch1基因表达水平观察其对肝癌细胞侵袭、转产物长度379bp；8-actin上游引物：5一TG-

4、移的影响。GAGGGGCCGGACTCGTCA．3，下游引物：5，_CTI'C—1材料与方法CTYCCT—GGGCATGGAG-3，PCR产物长度315bp。1．1材料人肝癌细胞HepG2、质粒Notchl细胞反应条件：Taq酶(5u／)0．1L，10×PCR-Buffer内段(pc-NICD)-pEGFP—C1及质粒pEGF—C1由东南2lxL，25mmol／LMgC121．2tzL，10Ixmol／IxL上、下大学外科研究中心冻存；Notchl干扰RNA质粒购自游引物各0．8IxL，10mmol／LdNTP1．6IxL，cDNAGen

5、script公司；脂质体。。。购自美国Invitrogen公司；1．0IxL，总体积25。循环参数：94℃预变性5RPMI一1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清及G418购min，94℃变性15s，特异退火温度30s，72℃延伸自Gibco公司；Westernblot分析所用抗体均购自30s，35个循环，72cC延伸5min。取PCR产物进行SantaCruz公司oDNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察并拍照，1．2方法采用图像分析软件ImageJ分析各条带灰度值，以内1．2．1细胞转染与稳定筛选首先筛选人肝癌细参相比，所得数值进行统计分析

6、。胞HepG2对G418致死浓度。在此基础上，将pc—1．2．3Notch1蛋白检测采用Westernblot技术。NICD(NICD／HepG2组)、干扰RNA(干扰RNA组)预冷的PBS将细胞沉淀洗涤2次后，加入细胞裂解和pEGF．CI空载体(空载体组)转入到HepG2细胞液，采用细胞刮将细胞刮下后收集到离心管中，冰上中，加入300Ixg／mLG418进行筛选，并以未处理的放置30rain，12000r／rain离心10min，吸取上清。人肝癌细胞HepG2(未处理HepG2组)作为对照，以采用考染法进行蛋白定量。加入4×loadin

7、gbuffer荧光显微镜检测单克隆细胞系的纯度，挑选单克隆，混匀，95℃金属浴煮5rain，样品便制备完成。电泳从而筛选稳定表达的细胞。分离后，采用半干法将PAGE胶中蛋白转印至PVDF1．2．2NotchlmRNA检测采用RT—PCR技术。膜上，恒流1mA／cm电转3h。转印结束后检查在收集的各组细胞中，加入1mLTrizol19PZO7h8PMarker。将转印好的膜放人配制好的5％脱脂奶粉24山东医药2014年第54卷第25期PBST配制，对膜进行封闭，室温包被1h。包被结束3讨论后，根据抗体说明书用PBST稀释一抗至最佳工作肝癌发

8、病隐匿，发展迅速，复发率、转移率、病死浓度，将膜用一抗包被，4℃过夜。将过夜的膜放置率均较高，预后较差。尽管肝癌的发病原因众多，但在摇床上室温平衡30min，用PBST洗涤3次，每次是其发病机