notch1在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞侵袭能力的影响

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1、第四军医大学硕士学位论文Notch1在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞侵袭能力的影响硕士研究生：张勇导师：王德盛副教授第四军医大学西京医院肝胆胰脾外科，西安710032资助基金项目：国家自然科学基金（No.30872480）陕西省科技研究发展计划项目（No.2012SF2-09-1）中文摘要关键词：原发性肝癌；Notch1；侵袭转移；基质金属蛋白酶原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在我国，原发性肝癌是排名第二的致死性肿瘤疾病，每年大约有11万-13万患者死于肝细胞性肝癌，占全球肝癌患者死亡人数的45%。随着现代检测及治疗手段的进步，原

2、发性肝癌治疗取得了长足进展，但由于其较高的转移及复发率，总体预后依旧较差，积极寻找一种早期准确预测肝细胞肝癌恶性程度及预后的指标变得十分迫切。Notch信号通路是一条进化上十分保守的信号转导系统，可调控细胞增殖、分化、凋亡等生物学行为。其主要由受体、配体、DNA结合蛋白三部分组成。在胞浆内生成的Notch受体在高尔基体中经Furin类转化酶水解为两部分，二者之间通过非共价键形成异源二聚体并被转运到细胞膜表面，当受体与配体结合后，在γ-分泌酶的水解作用下，切割Notch受体跨膜区，并释放Notch胞内段进入细胞核，从而启动下游基因的转录，调控一

3、系列生命活动。Notch1是Notch信号通路的跨膜受体之一，大量研究发现，Notch1在多种肿瘤中异常表达，并且与肿瘤侵袭及转移相关。但在肝癌中，-2-第四军医大学硕士学位论文Notch1的作用尚不明确。目的：研究Notch1在肝细胞肝癌组织中的表达情况及其与肝癌临床病理特征的关系。检测不同侵袭能力肝肿瘤及非肿瘤细胞系中Notch1的表达情况，设计合成特异性Notch1-siRNA，研究Notch1在肝癌细胞系MHCC97-H及HepG2侵袭转移中的作用及其相关潜在机制。方法：用免疫组织化学法(SP法)检测110例肝癌组织及其癌旁组织中No

4、tch1表达情况，并分析Notch1表达与肝癌各项临床病理指标之间的相关性。用Westernblot方法检测肝非肿瘤细胞系HL-7702、肝癌细胞系HepG2和MHCC97-H三种不同侵袭能力的细胞系中Notch1蛋白的表达情况，设计并合成针对Notch1基因特异性的小干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）,采用脂质体转染MHCC97-H及HepG2两种肝癌细胞系，通过Westernblot及实时定量PCR法分别检测转染后各组细胞Notch1蛋白和mRNA表达水平的变化。应用特异性Notch1-siRNA转染的Hep

5、G2及MHCC97-H细胞，体外通过transwell小室基质侵袭实验，观察Notch1表达沉默之后，这两种肝癌细胞系侵袭能力的变化，并应用Westernblot及ELISA的方法分别检测两种细胞系转染前后MMP-2及MMP-9表达量以及活性的变化情况。结果：免疫组织化学染色发现，Notch1阳性染色主要位于细胞膜中，为棕色及棕黄色颗粒样，细胞浆中也有所表达。在肝癌组织中，30例（27.3%）阴性表达，32例（29.1%）弱阳性表达，21例（19.1%）中等阳性表达，27例（24.5%）强阳性表达。Notch1在肝癌组织中表达存在差异。在癌旁

6、组织中，仅部分染色显示为弱阳性，其余均为阴2性。肝癌组织中Notch1的阳性表达与肝癌的AJCC分期（χ=22.123，P<0.001）、门22静脉癌栓（χ=9.068，P=0.003）这些因素存在正相关性,与肝癌的分化程度（χ=6.490，22P=0.011）存在负相关性；而与肝癌患者的性别（χ=0.490，P=0.484）、年龄（χ=0.188，22P=0.664）、肿瘤直径（χ=0.002，P=0.961）、肿瘤数量（χ=2.220，P=0.136）、AFP2表达量（χ=1.392，P=0.238）这些因素无关。相比肝非肿瘤细胞系，No

7、tch1在两种肝癌细胞系中均高表达。特异性Notch1-siRNA转染MHCC97-H以及HepG2后，通过westernblot和实时定量PCR的方法-3-第四军医大学硕士学位论文检测发现这两种肝癌细胞系中Notch1蛋白以及mRNA的表达均显著下降，该siRNA可以成功的干涉Notch1的表达。应用特异性Notch1-siRNA沉默肝癌细胞系MHCC97-H及HepG2中Notch1的表达，侵袭实验结果显示：Notch1-siRNA组两种细胞系穿透小室膜的细胞数目明显减少。Westernblot及ELLISA实验检测发现，Notch1-s

8、iRNA组两种细胞的MMP-2及MMP-9的表达和活性均降低。结论：Notch1参与了肝癌侵袭转移的调控过程，特异性的Notch1-siRNA可以抑制肝癌细胞系MH