vwf和hdac1在胃癌细胞株bgc823中的表达及对细胞粘附侵袭迁移能力的影响

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1、vWF和HDAC1在胃癌细胞株BGC823中的表达及对细胞粘附侵袭迁移能力的影响：王敏，刘伟，杨爱军，王晨昱，李敏【摘要】目的：研究血管性血友病因子（vTT）法检测对细胞外基质成分Ⅳ型胶原粘附能力的变化；Boyden小室法检测细胞侵袭、迁移能力的改变.结果：BGC823细胞能够表达vETHODS:HumangastriccancercelllineBGC823culturedinvitromunocytochemistry.TheeffectsofvI1640（美国Gibco公司）；胰酶(美国Amresco公司)；超级新生牛血清（FBS）（杭州四季青生物工程有限公司）；Ⅳ型胶原（

2、兰州大学病理研究所自制）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）及牛血清白蛋白（BSA）（美国Sigma公司）；兔抗人varker（D512A）（TakaRa）；博伊登(Boyden)小室与多聚碳酸酯膜(8.0μm孔径)（美国Millipore公司）；人胃癌细胞株BGC823（中国科学院上海细胞生物研究所）.　　1.2方法　　1.2.1细胞培养用含100mL/L灭活新生牛血清的RPMI1640培养液（含105U/L青霉素、100mg/L链霉素）在37℃50mL/LCO2及饱和湿度的培养箱中维持培养.　　1.2.2SP法免疫细胞化学染色取对数生长期BGC823细胞，消化离心后，将细胞悬液加入已预置无

3、菌小玻片的12孔板中，每孔含细胞2×104个，培养36h后，取出盖玻片，PBS洗3次，4℃无水乙醇固定.免疫组化参照试剂说明书进行，苏木精轻度复染，脱水透明，显微镜下观察结果.PBS代替一抗做阴性对照.判断标准：HDAC1以细胞核呈清晰棕黄色颗粒为阳性细胞，vV第一链cDNA合成试剂盒说明书操作合成cDNA，以OligodT为引物反转录，vI1640培养基中，与BGC823细胞共培养48h；将96孔板预先用3g／mLⅣ型胶原20μL／孔包被，20mL/LBSA封板处理，加入调好的细胞悬液200μL／孔（5×105个／mL）；CO2培养箱分别孵育30，60，90和120min后，弃去培

4、养液，PBS冲洗除去未粘附细胞；弃PBS后加入MTT20μL，及无血清RPMI1640200μL，CO2孵育3h；吸弃培养孔内上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）200μL溶解，噻唑兰显色，酶联免疫检测仪570nm处测各孔吸光度（A570nm）值，同时设立相应的RPMI1640培养对照组.各组重复3次.　　1.2.5体外侵袭抑制实验分别将20μg/mLvI1640培养基中，与BGC823细胞共培养48h，对照组不做抗体处理；在Boyden小室的下室加入含有500mL/LFBS的培养液200μL，上下室之间用孔径8μm的聚碳酸酯膜分开，膜上均匀铺浓度为3g／mL的Ⅳ型胶原50μL／室，

5、将小室置于37℃温箱中聚合30min.上室内加入预处理的细胞悬液200μL／室（含2×105个细胞），37℃50mL/LCO2条件下放置48h.弃上室液体，用棉签擦掉膜上未侵袭细胞及胶，PBS洗3次，950mL/L乙醇固定15min，常规HE染色.结果判定：在400倍光镜下每个滤膜分别计数5个视野的穿膜细胞数，计算平均每个视野的细胞数.实验组和对照组重复3次.按下式计算抗体作用对细胞侵袭的抑制率(IR):IR(%)=(1-实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数)×100%.　　1.2.6体外迁移抑制实验细胞处理同侵袭实验，聚碳酸酯膜表面不铺胶，其余步骤同侵袭实验.通过计数穿膜细胞数反映

6、vWF及HDAC1对BGC823细胞体外迁移能力的影响.按下式计算抗体作用对细胞迁移的抑制率(IR):IR(%)=(1-实验组平均迁移细胞数/对照组平均迁移细胞数)×100%.　　A:HDAC1;B:vodPathol,2005,18:388-397.　　［3］TerraubeV,PenduR,BaruchD,etal.IncreasedmetastaticpotentialoftumorcellsinvonoriyamaS,NakashimaY,etal.Histonedeacetylase1mRNAexpressioninlungcancer［J］.LungCancer,2004,4

7、6:171-178.