应用pcr_dgge技术研究储藏小麦中的真菌多样性

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1、第４３卷应用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术研究储藏小麦中的真菌多样性·４１·檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱殗殗檱檱谷物化学与品质分析檱檱殗殗檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱应用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术＊研究储藏小麦中的真菌多样性都立辉和肖营张虹宋伟袁建鞠兴荣刘兵（南京财经大学食品科学与工程学院，粮食储运国家工程实验室２１００２３）摘要弄清粮食储藏期间真菌的种类及其生长演变规律是实现储粮减损的重要前提。本研究着眼于储粮真菌的种类问题，以储藏小麦为载体，将ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术应用于储粮真菌多样性的分析中。研究结果表明本次储藏小麦样品中生长的真菌主要为帚状曲霉、

2、枯叶格孢腔菌、枝孢菌和假丝酵母。虽然在ＤＧＧＥ的谱图中出现了一些非真菌条带，但是这些条带与真菌的条带明显分布在两个区域，不会影响到真菌条带的分析。研究结果确立了ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术用于储粮生态体系中真菌多样性分析的流程和方法，为利用此技术监测储粮生态系统中的真菌种类奠定了基础，并为建立储粮真菌生长演变谱图数据库积累了部分初步资料。关键词储粮真菌多样性ＤＧＧＥ细菌和真菌污染构成了储粮损失中很重要的部段长度多态技术（ＡＦＬＰ）将从韩国８个不同地区分，因此储粮减损是粮食领域科研工作者研究的重采集到的玉米中分离出的５６８株镰刀菌分成了４个点

3、之一。虽然细菌污染会影响储粮的安全和后期的谱系，并通过分析推断其中的一个谱系可能是近期［１］［３］加工，但是真菌的污染对储粮的危害更大。储粮随着玉米种子的进口而引入韩国的。生态中各真菌菌种的生长有一定的顺序，一般最开国内现有文献中有关储粮中真菌的多样性及生始繁殖的真菌是水分活度要求较低的嗜旱霉菌（如长变化规律的研究多采用传统分离培养的方［１，４］Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｐｅｎｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ），这些先锋菌种在储粮法，但是由于培养条件的限制，该方法不但耗环境中生长代谢后会引起水分活度的升高，其它一时很长，且很难全面地反映出储粮中所

4、有真菌的组些真菌，包括产毒真菌（如Ａ．ｆｌａｖｕｓ、成及含量。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术作为近年来新兴的一Ａ．ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）就可以生长起来并开种可用于微生物分子生态学研究的工具，通过扩增［２］始产生真菌毒素。因此储粮生态系统中真菌的组群体中各种微生物的特定核苷酸片段，能检测出样［５］成及变化规律研究对建立安全有效的储粮方式显得品中９０％～９９％的微生物物种。目前该技术已［６］非常重要，而建立相应的真菌种类和多样性监测和广泛用于多种样品中微生物的多样性研究，并且检测手段是实现这一目标的必要前提。已经有研究者开

5、始利用该技术对一些复杂生态系统［７～９］国外有关储粮真菌方面的研究多数集中在一些中的真菌多样性进行研究。基于此，本研究以产毒真菌的生长及产毒情况的研究，采用的菌株常储藏小麦为载体，尝试将ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术应用为已知的产毒菌株，全面研究储粮期间的真菌种属于储粮真菌多样性的分析，探索建立一种较快速监多样性的报道较少。最近有人对韩国玉米中的镰刀测粮食储藏期间真菌种属的方法，以期为将来全面菌菌群结构和毒素产生情况进行研究，采用扩增片分析储粮生态系统中的真菌组成及变化规律提供一＊基金项目：粮食公益性行业科研专项（２０１３１３００２）；国家自

6、然科学基金（３１１０１３３８）和江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室开放基金（ＬＹＰＫ２０１３０２）通讯地址：南京市栖霞区文苑路３号·４２·粮食储藏２０１４（５）种可实施的技术和方法，并且随着ＰＣＲ－ＤＧＧＥ１．５％琼脂糖凝胶电泳检测。谱图数据的积累，这一方法将有助于储粮真菌生长１．４．２变性梯度凝胶电泳采用变性梯度凝胶电演变谱图数据库的开发和建立。泳系统（ＤＧＧＥ－１００１，ＣＢＳ，美国）进行梯度凝胶电泳分析。电泳条件为：变性梯度范围为１５％１材料和方法［１０］～５０％，ＤＮＡ扩增产物上样量为１０μＬ，电泳缓冲液为１×ＴＡＥ缓

7、冲液，１００Ｖ电泳１２ｈ左右。１．１样品来源和处理电泳完毕后的凝胶使用ＥＢ染色１５ｍｉｎ，利用凝胶小麦购于当地超市。装袋后运输至实验室，室［１１］图像分析仪照相。温储藏１个月后作为实验样品。１．４．３ＤＮＡ的回收测序在紫外灯下切下ＤＧＧＥ１．２主要培养基及试剂胶上不同位置的条带，置于２０μＬ４℃无菌纯净水马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）购自北京；中过夜。取２μＬ为模板ＤＮＡ进行１８ＳｒＤＮＡ可ＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒｆｏｒＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｔｏＤｉｒｅｃｔＰＣＲ试剂变区域扩增（条件同上）。ＰＣＲ产物经ＤＧＧＥ后证盒，ＴａｑＤＮ

8、Ａ聚合酶购自大连；ＰＣＲ引物的合成明与所割条带位于相同的迁移位置，再割胶回收，以及ＤＮＡ序列的测定由上海某公司完成；其余试用不含ＧＣ夹子的引物再次扩增该可变区序列，纯剂为分析纯。化后用１．５％琼脂糖凝胶电泳检验，送回公司测１．３霉菌的