口蹄疫病毒解旋酶恒温扩增检测方法的建立

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1、贵州畜牧兽医2014年第38卷第5期·1·口蹄疫病毒解旋酶恒温扩增检测方法的建立12342211*金静维，马保华，邱索平，凌彬冰，李贺，胡晓冰，曹永长，薛春宜(1．中山大学生命科学学院，广东广州510006;2．南海出入境检验检疫局，广东佛山528200;3．从化出入境检验检疫局，广东广州510900;4．UniversityofSaskatchewan，SaskatchewanS7N5C9，Canada)摘要:针对FMDV编码3D蛋白(ＲNA聚合酶)的保守序列设计特异性引物，利用逆转录解旋酶恒温扩增技术(ＲeverseTransc

2、riptionhelicase－dependentisothermalamplification，ＲT－HDA)建立了口蹄疫病毒(foot－and－mouthdiseasevirus，FMDV)快速检测方法。该方法可在65℃下，120min内实现对口蹄疫病毒保守序列的大量扩增。该方法可检测到0．2ng的FMDV核酸量，比普通ＲT－PCＲ高10倍;具有极高的特异性，除了能对FMDV核酸进行扩增外，对其他临床症状与口蹄疫类似的病毒，如水泡病病毒(SVDV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PＲＲSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)

3、和水泡性口炎病毒(VSV)的核酸，则不能扩增出目的片段。FMDV的ＲT－HDA检测方法灵敏度和特异性高，而且不需要昂贵的仪器设备，具有广阔的应用前景。关键词:口蹄疫病毒;逆转录解旋酶恒温扩增;检测中图分类号:S852．65文献标识码:A文章编号:1007－1474(2014)05－0001－05口蹄疫(foot－and－mouthdisease，FMD)又称法如环介导恒温扩增(LAMP)、链替换扩增(SDA)、口疮热，是由口蹄疫病毒(foot－and－mouthdisease转录介导的恒温扩增(TMA)等的出现，恒温扩增方virus

4、，FMDV)引起的急性、热性、高度接触性人畜共法已经在病原体检测上得到了广泛的应用。解旋酶［1］患传染病，主要侵害的对象是猪、牛、羊等偶蹄类恒温扩增方法(Helicase－dependentisothermalDNA动物，在特定条件下还可以引发人的感染。FMD在amplification，HDA)是新近发明的一种简便、快速、易感动物中发病率可达100%，并形成大范围流高效的体外恒温基因扩增技术。该法依靠DNA解行［2］。许多国家或地区都曾经有过FMD流行的历旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持史，自然发病率高，由于其

5、大范围流行不仅会严重影单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。与其它恒温基因扩增技术相比，HDA更简单、有效，是一种响畜牧业乃至整个国民经济的健康持续发展，造成［6，7］崭新的基因扩增方法。本文针对FMDV编码巨大的经济损失，甚至还会带来政治影响，素有“政［3］3D蛋白(ＲNA聚合酶)的保守序列设计特异性引治经济病”之称。由于FMD危害大，被世界动物物，利用ＲT－HDA技术建立了FMDV解旋酶恒温卫生组织和联合国粮农组织列为A类动物传染病［4］扩增检测方法。FMDV的ＲT－HDA检测方法灵敏之首。度和特异性高，而且不需要昂贵的仪器设

6、备，具有广鉴于FMD的严重危害，快速、准确、简单的检测阔的应用前景。方法是关键。传统的实验室方法包括病毒分离、血清学试验、ＲT－PCＲ等，这些方法不是太耗时就是1材料与方法［5］需要昂贵的仪器。随着不同的核酸恒温扩增方1．1试剂和仪器收稿日期:2014－04－181．1．1试剂:Tte－UvrD解旋酶(0．5mg/mL)、10×基金项目:广东出入境检验检疫局科技项目(2011GDK45、2013GDK04)AnnealingBufferⅡ(10mmol/LKCland20mmol/L作者简介:金静维(1988—)，男，江西省丰城人，

7、硕士研究生，主要从Tris－Cl，pH8．8，at25℃)、MgSO4(100mM)、NaCl事营养与免疫研究。*通讯作者:薛春宜。E－mail:xuechy@mail．sysu．edu．cn(500mM)，均购置于Biohelix;BstDNAPolymerase·2·贵州畜牧兽医2014年第38卷第5期LargeFragment，购置于NewEnglandBiolabs;Ther-引物5’－cccaacgcaggtaaagtgat－3’，预计片段长度moScriptＲT逆转录酶，购置于Invitrogen;体液病毒为255bp，

8、引物由Invitrogen公司合成。DNA/ＲNA小量试剂盒，购置于Axygen;0．1%BSA，1．4病毒核酸的提取所有病毒ＲNA均用体液病购置于Fermentas;ATP和dATP(100mM)、dNTPs毒DNA/ＲNA小量试剂