O型口蹄疫病毒Real-timePCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、动物医学进展。2014，35(1)：50—53ProgressinVeterinaryMedicineO型口蹄疫病毒Real—timePCR检测方法的建立胡骑，信爱国，李华春(云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明650224)摘要：为建立一种可以快速、准确检测0型口蹄疫病毒的TaqMan荧光定量PCR方法，根据O型口蹄疫病毒VP1基因保守区序列设计特异性引物和TaqMan探针，使用MagMaxExpress核酸自动提取系统提取O型口蹄疫病毒FMD／O／YM／YN／2000株病毒核酸，建立了检测O型口蹄疫病毒的实时荧光定量PC

2、R方法。该方法标准曲线相关系数达0．9993，最低检测量达到1．79个拷贝，比传统荧光定量PCR方法灵敏1O倍以上，特异性强。该方法可以在2．5h内检测96份临床样品，相对于传统荧光定量PCR方法，效率提高2倍以上。采用MagMaxExpress核酸自动提取系统配合7500Fastreal—timePCRsystem建立的方法可以实现快速、准确检测O型口蹄疫病毒。关键词：口蹄疫病毒；实时荧光定量PCR；大通量检测中图分类号：$852．659．6；Q789文献标识码：A文章编号：1007—5038(2014)01—0050—04口蹄疫(Footandmou

3、thdisease，FMD)是由口1．2方法蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus，FMDV)1．2．1RNA提取使用MagMaxExpress系统和引起的以偶蹄动物感染为主的急性、热性、高度接触MagMax96ViralRNAIsolationKit提取试验所需性传染病。该病在全世界范围内分布，由于其危害总RNA。整个RNA提取过程约耗时30min，只需性大，暴发时会造成人们生活和社会经济的不稳将所需试剂加入板中对应孔，其余全部自动操作。定_1]。FMDV现有O、A、C(欧洲型)，Asia一1(亚洲操作程序为：①每孔加50L样品至1

4、30FLLysis／型)、SAT1、SAT2、SAT3(非洲型)7个血清型，针对Bindingsolution；②每孔加2OL磁珠，混匀5min；不同型病毒的血清之间无交叉保护。FMD被世界③收集吸附RNA的磁珠，并小心弃上清；④使用动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病_2]。150FLWashsolutionI洗2次；⑤使用15O肚LMagMaxExpress大通量核酸自动提取系统由美国washsolution1I洗2次；⑥甩干磁珠2min；⑦将RNA溶解于20L～5OLElutionbuffer中。AB公司开发，具有快速、准确、方便的特点。本研

5、究1．2．2标准曲线制备及样品检测使用Nanovue应用MagMaxExpress系统和Fastreal—timePCRPlus核酸测定仪测得标准毒株FMD／O／YM／YN／系统建立了快速、大量检测O型口蹄疫病毒的大通2000核酸浓度为0．134ng／FL，已知该毒株碱基数量real—timePCR方法。为8813，可根据公式6．O2×1O∞×0．134×10／1材料与方法(8813×340)一2．1×10copies／gL，10倍梯度稀释1．1材料样品至2．1×10copies／FL，作为标准品。按照O1．1．1标准毒株O型口蹄疫病毒FMD／O／YM／

6、型口蹄疫病毒VP1基因片段保守区序列设计引物，YN／2000株，由云南省热带亚热带动物病毒病重点上游引物P1：5一GGGAATTAGGCTTATTG—实验室保存。GATTT一3，下游引物P2：5，_CCGATTTGATAG—1．1．2仪器设备及试剂MagMaxExpress、7500GCGGCTGGTAA一3，TaqMan探针：5，_TTAG—FastReal—timeSystem均为美国AB公司产品；GCATTGACGGATC一3；扩增片段长度为105bp。NanovuePlus为美国GE公司产品；TaKaRaOnePCR扩增体系(25FL)如下：2×

7、0neStepRT-PCRStepPrimeScriptRT—PCRKit(PerfectReal—time)，buffer12．5FL，TaKaRaEXTaqHS0．5FL，PrimeDNAMarker50bp为宝生物工程(大连)有限公司ScriptRTEnzymeMix0．5uL，P10．5“L，P2产品。0．5L，TaqMan探针1L，RNA2L，RNasefree收稿日期：2013—07—30基金项目：农业部公益性行业(农业)科研专项(201103008)作者简介：胡骑(1980一)，男，云南昆明人，主要从事动物传染病学研究。*通讯作者胡骑等：O

8、型口蹄疫病毒Real—timePCR检测方法的建立51dH2O7．5L。扩增条件