中国美利奴绵羊磷脂酶czeta基因表达载体的构建及原核表达

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1、动物医学进展，２０１４，３５（１２）：１０４－１０９ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ中国美利奴绵羊磷脂酶Ｃｚｅｔａ基因表达载体的构建及原核表达木尔扎提·阿勒腾别克１，刘强１，贺志锐１，王银龙１，乌热力哈孜１，赛务加甫１＊（石河子大学动物科技学院，新疆石河子８３２００３）摘要：构建美利奴绵羊磷脂酶Ｃｚｅｔａ（ＰＬＣζ）融合蛋白表达载体，并在原核细胞内表达及纯化，为其特异性抗体的制备及生物学功能研究奠定基础。用ＰＣＲ技术扩增出ＰＬＣζ基因片段，亚克隆到原核表达载体ｐＣｚｎ１中，导入ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓＴＭ（ＤＥ３）感受态细胞，ＩＰＴＧ诱导表达，收样后进行ＳＤＳ－

2、ＰＡＧＥ电泳或Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检验ＰＬＣζ的表达情况。用镍离子亲和层析的方法大量纯化融合蛋白。结果显示，重组质粒经ＰＣＲ、酶切和测序鉴定证明载体构建正确。ｐＣｚｎ１表达载体在ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓＴＭ（ＤＥ３）表达菌中能很好地表达融合蛋白。表达纯化后可获得了分子量约７４ｋｕ的融合蛋白，符合预期大小。成功构建ｐＣｚｎ１－ＰＬＣζ原核表达载体，表达并纯化了其融合蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验表明其蛋白分子的完整性良好，这将有利于对ＰＬＣζ蛋白进行深入的研究。关键词：磷脂酶Ｃｚｅｔａ蛋白；原核表达；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ中图分类号：Ｑ７８９；Ｓ８５２．２文献标识码：Ａ文章编号：１０

3、０７－５０３８（２０１４）１２－０１０４－０６磷脂酶Ｃｚｅｔａ（ＰＬＣζ）是ＳａｕｎｄｅｒｓＣＭ等通过近年来，在鉴定精子因子的生化本质上取得了生物信息学分析和ｃＤＮＡ文库筛选，在小鼠睾丸中突破性进展，研究认为单个精子含有的ＰＬＣζ足够发现一种新的精子特异的磷脂酶Ｃ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ引起卵母细胞钙振荡，促使受精卵正常发育。研究［７－９］［１０－１１］Ｃ，ＰＬＣ），是磷脂酶Ｃ家族（ＰＬＣｓ）中基因长度最短人员对人和鼠的ＰＬＣζ进行了多方面的探的一个亚型。ＰＬＣζ基因由１９０５ｂｐ组成，编码６３４讨，在家畜上也已有猪、牛、马等ＰＬＣζ基因的研究个氨基酸。ＰＬＣζ触发的小鼠卵母细胞Ｃａ

4、２＋振荡与报道，而对于绵羊的ＰＬＣζ基因研究甚少。受精时产生的Ｃａ２＋振荡相似，通过免疫消耗法从精为此，我们构建了ｐＣｚｎ１原核表达载体，导入子提取物中除去ＰＬＣζ，则不能引起卵母细胞钙的释ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓＴＭ（ＤＥ３）感受态细胞，ＩＰＴＧ诱导放。此后，在牛［１］、鸡［２］、猪［３－４］和马［５］等物种上相继表达，收样后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳或Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴别出ＰＬＣζ基因的存在。研究发现精子蛋白检验ＰＬＣζ的表达情况。用镍离子亲和层析的方法ＰＬＣζ呈现精子因子（ｓｐｅｒｍｆａｃｔｏｒ，ＳＦ）活性，可激活大量纯化融合蛋白，这将有利于对ＰＬＣζ蛋白理化卵母细胞的发育［

5、６］。在线专业蛋白质分析系统（ｈｔ－性质进行深入的研究。ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）对美利奴绵羊ＰＬＣζ基因１材料与方法推导的氨基酸进行分析，表明其具有典型的ＥＦ－１．１材料ｈａｎｄ钙结合结构域、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Ｘ结大肠埃希菌ＤＨ５α、ｐＥＴ－２８ａ（＋）原核表达载构域、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Ｙ结构域、蛋白激体，Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３），Ｅ．ｃｏｌｉＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓＴＭ酶Ｃ２保守区域，其中Ｘ结构域中包含２个磷酸肌（ＤＥ３）菌株均由石河子大学临床实验室保存；原核醇特异性磷脂酶Ｃ的组氨酸活性位点（１７０和２１５表达载体ｐＣｚｎ１（购自钟鼎生物技术有限公司）

6、，限氨基酸位点）是构成催化活性中心所必须的。据此制性内切酶ＮｄｅⅠ和ＸｈｏⅠ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、推测，ＰＬＣζ的精子因子活性与Ｘ和Ｙ结构域之间ＰＣＲ反应试剂、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ均购自宝生物工程的连接区域有关。（大连）有限公司；蛋白Ｍａｒｋｅｒ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｒｓ公收稿日期：２０１４－０４－２８基金项目：国家自然科学基金项目（３１１６０５２４）作者简介：木尔扎提·阿勒腾别克（１９８９－），男（哈萨克族），新疆阿勒泰人，硕士研究生，主要从事兽医外产科学研究。　＊通讯作者木尔扎提·阿勒腾别克等：中国美利奴绵羊磷脂酶Ｃｚｅｔａ基因表达载体的构建及原核表达１０５司；Ｅａｓｙｓｅｅｗｅｓｔｅｒｎ

7、ｍａｒｋｅｒ购自北京全式金生物技质粒进行酶切鉴定。术有限公司；２×ＥｓＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ、质粒ＤＮＡ小量１．２．４ｐＥＴ－２８ａ－ＰＬＣζ重组质粒构建分别取空制备试剂盒和ＤＮＡ凝胶回收试剂盒、抗Ｈｉｓ标签ｐＥＴ－２８ａ载体和回收的ＰＣＲ产物用ＮｄｅⅠ和兔多克隆抗体购自北京康为世纪生物有限公司；ＸｈｏｌＩ进行双酶切。３７℃酶切４ｈ后，将反应产物ＰＣＲ产物纯化试剂盒购自上海捷瑞生物技术有限在１０ｇ／Ｌ的琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射仪