一年生簇毛麦醇溶蛋白基因的分离、原核表达与功能鉴定

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1、作物学报ACTAAGRONOMICASINICA2014,40(8):13401349http://zwxb.chinacrops.org/ISSN0496-3490;CODENTSHPA9E-mail:xbzw@chinajournal.net.cnDOI:10.3724/SP.J.1006.2014.01340一年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因的分离、原核表达与功能鉴定11,21,2,*1,2,*111杨帆陈其皎高翔赵万春强琴琴吴丹孟敏12西北农林科技大学农学院,陕西杨凌712100;陕西省小麦新品种培育工程研究中心,陕西杨凌712100摘要:醇溶蛋白是面筋的主

2、要成分之一,对小麦品质具有重要影响。根据数据库中全长α-醇溶蛋白基因设计了1对通用引物,从5份一年生簇毛麦(Dasypyrumvillosum)品系中共得到52条序列,长度在816~873bp之间(GenBank登录号为KJ004676~KJ004727)。核酸序列分析表明,其中有8条假基因,有1条(KJ004680)缺失终止密码子。推导氨基酸序列显示,KJ004677、KJ004686、KJ004714和KJ004696含有1个额外的Cys,其中,前3条序列由于Tyr→Cys所致,而KJ004696则由于Ser→Cys突变。序列间的差异主要出现在N-端重复区和

3、多聚谷氨酰胺I区,根据N端重复区多肽序列的差异将一年生簇毛麦α-醇溶蛋白分为5种类型。为了分析具有额外Cys的α-醇溶蛋白所具有的品质效应,选取KJ004708(具有典型的6个Cys)和KJ004714(具有1个额外的Cys)分别构建表达载体,IPTG诱导后均得到分子量约30kD的蛋白,与理论值相符;目的条带经切胶串联质谱鉴定证明,这2个α-醇溶蛋白基因在大肠杆菌中正确表达。对表达的蛋白亚基进行纯化、复性和低温冷冻干燥,经4g粉质仪分析表明,KJ004708和KJ004714均能改善面团的加工品质,其中具有1个额外Cys的KJ004714亚基对面粉品质的改善更为

4、显著。关键词:一年生簇毛麦;α-醇溶蛋白;原核表达;品质分析;蛋白质串联质谱鉴定Cloning,ProkaryoticExpressionandinvitroFunctionalAnalysisofα-GliadinGenesfromDasypyrumvillosum11,21,2,*1,2,*11YANGFan,CHENQi-Jiao,GAOXiang,ZHAOWan-Chun,JIANGQin-Qin,WUDan,and1MENGMin12CollegeofAgronomy,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,Chin

5、a;NewVarietiesCultivationofWheatEngineeringResearchCentreofShaanxiProvince,Yangling712100,ChinaAbstract:Gliadin,whichhasagreateffectonwheatquality,isoneofmaincomponentsingluten.Accordingtothefulllengthsofα-gliadingenesdepositedinNCBIdatabase,aconservedprimerpairwasdesignedtocloneα-gl

6、iadingenesinfiveDasypyrumvillosumlines.Atotal52sequences(816to873bpinlength)wereisolated(GenBankaccessionnumbers:KJ004676toKJ004727)includingeightpseudogenesandanothersequenceKJ004680withoutstopcodon.DeducedaminoacidsequenceanaylsisshowedthatKJ004677,KJ004686,andKJ004714containanextr

7、aCysfromtheTyr→Cysmutation,whereas,theextraCysinKJ004696resultedfromtheSer→Cysmutation.AminoacidvariationmainlyoccurredinN-terminalrepetitiveregionandpolyglutaminedomainI.VariationinN-terminalrepetitiveregionformedfivegroupsinthe43α-gliadins.TostudytheeffectsofanextraCysondoughqualit

8、y,weconstruc