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时间:2018-04-10
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1、6羟基多巴胺诱导SHSY5Y细胞帕金森病模型中1433蛋白表达的研究:王丹萍常明解洪荣田明秀胡林森【摘要】目的应用蛋白质组学技术研究6羟基多巴胺(6OHDA)诱导SHSY5Y细胞帕金森病(PD)模型中1433蛋白的表达变化。方法在建立6OHDA诱导SHSY5Y细胞PD模型的基础上,分别提取6OHDA实验组和对照组孵育24h的细胞总蛋白,应用荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)技术获得蛋白点的差异表达信息,运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDITOFMS)鉴定出差异蛋白质。结果DIGE分析发现实验组有一
2、个表达明显上调的差异蛋白质点(P<0.05),经质谱分析鉴定确认为1433蛋白。结论6OHDA诱导SHSY5Y细胞的PD模型中1433蛋白表达上调,提示1433蛋白上调可能与PD的发病机制有关。【关键词】6羟基多巴胺;SHSY5Y;帕金森病;1433蛋白;IDGE帕金森病(PD)是一种常见的中老年神经系统变性疾病,其病理特征是中脑黑质致密部多巴胺(DA)能神经元进行性变性、坏死,但PD的发病机制现仍不完全清楚。神经毒素6羟基多巴胺(6OHDA)是DA神经递质的羟基化类似物和选择性DA神经元化学损毁剂,它
3、选择性地作用于DA神经元,适用于研究DA能神经变性的详细机制及筛选新的治疗药物。SHSY5Y细胞系于人神经母细胞瘤株,其分化程度低、繁殖快,细胞形态、生理及生化功能与人正常神经细胞相似〔1〕。迄今为止尚无应用蛋白质组学技术对该模型进行系统研究的报告。本实验在建立6OHDA诱导SHSY5Y细胞PD模型的基础上应用荧光差异凝胶电泳(DifferentialGelElectrophoresis,DIGE)技术研究6OHDA对SHSY5Y细胞毒性作用机制中的相关蛋白,为PD的发病机制及临床治疗提供理论依据。 1材料与方法 1.1细
4、胞、试剂及仪器SHSY5Y细胞来自AmericanTypeCultureCollection(ATCC)。6OHDA、DMSO、胰蛋白酶购自Sigma公司。高糖DMEM培养基购自Gibco公司;新生胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;Cleanup试剂盒、2DQuant试剂盒、固相24cmIPG胶条(pH4~7)、CyDye荧光染料(Cy2,Cy3,Cy5)以及其他双向电泳和质谱分析试剂,EttanIPGphorⅡ等电聚焦仪、DALTSix垂直电泳系统、切胶仪、酶切仪、点靶仪和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(M
5、ALDITOFMS)均购自AmershamBiosciencesGEHealthcare公司。荧光倒置显微镜为Olympus公司产品。 1.2方法 1.2.1细胞培养用含5%的新生胎牛血清、100μg/ml青霉素/链霉素的高糖DMEM培养基培养细胞,置于37℃、5%CO2培养箱中,隔天换液。待细胞进入对数生长期后,用0.25%的胰蛋白酶消化后,以2×105/ml密度接种于底面积25cm2的培养瓶(15ml/瓶)。孵育24h后,实验组和对照组分别加入6OHDA(终浓度为6OHDA100μmol/L,VitC0.002%)和0
6、.2%VitC溶液(终浓度为0.002%),继续孵育24h。取4批不同代数的细胞进行培养。 1.2.2蛋白提取收取细胞,加入细胞裂解液(7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS,30mmol/LTris),经室温作用1h后离心取上清。蛋白样品经cleanup试剂盒去除杂质后,再用2DQuant试剂盒测定浓度。 1.2.3DIGE将各样品pH值调至8.5,进行分组并制备内标,再以400pmolCyDye:50μg蛋白的比例标记各样品及内标,避光冰浴30min后,用1μl10mmol/L赖氨酸终止反应。分析胶:内标蛋白、
7、对照组及实验组蛋白分别进行荧光(Cy2、Cy3、Cy5)标记。按标准实验规程进行水化及聚焦电泳:采用线性IPG胶条(pH4~7),定量蛋白上样,水化和电泳,并灌制24cm×20cmPAGE胶,进行IPG胶条平衡及转移,24cm电泳仪垂直电泳。制备胶:取对照组及实验组蛋白样品各800μg,酸性端放置蛋白分子量标志,按分析胶方法进行双向电泳。考马斯亮蓝染色。 1.2.4图像分析及统计学处理使用Typhoon9400扫描仪对分析胶进行图像扫描,并且以DeCyderTM分析软件进行蛋白变化比对,其中AV比值>1.5,配对t检验P<
8、0.05为有显著差异的蛋白点。切取与差异蛋白相匹配的制备胶蛋白点,经酶切(20μg/L胰酶,37℃,2h)、点靶后,应用MALDITOFMS分析蛋白质肽质量指纹谱,并将结果输入NCBI蛋白质数据库进行检索
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