shsy5y神经细胞中尼古丁受体α3亚单位基因表达抑制与app代谢的关系

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1、SHSY5Y神经细胞中尼古丁受体α3亚单位基因表达抑制与APP代谢的关系作者：唐智安宇齐晓岚肖雁单可人官志忠【摘要】目的用RNA干扰技术抑制神经型尼古丁受体(nAChR)α3亚单位基因表达并观察对神经细胞淀粉样蛋白前体蛋白（APP）代谢的影响。方法设计并体外合成α3nAChR的特异性编码siRNA序列的寡核苷酸，退火后克隆至pSliencer3.1H1neo质粒中，构建重组质粒α3nAChRpSilencer3.1H1neo。将α3nAChRpSilencer3.1H1neo转染SHSY5Y细胞，用含G418的培养液筛选，挑选阳

2、性克隆后采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测转染细胞中α3nAChRmRNA及蛋白表达水平的变化；并测定分泌型APP、总APP蛋白表达的变化。结果成功构建α3nAChRsiRNA表达质粒，转染后经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞克隆株，与对照组相比，α3nAChRmRNA及蛋白表达量均降低（抑制率分别为98%和66%）；分泌型APP表达下降，总APP水平比较表达水平无显著性差异。结论α3nAChRsiRNA表达质粒能特异性抑制α3nAChR基因表达，α3nAChR可能通过增加α分泌酶对APP的切割发挥神经保护作用。【关键词】

3、siRNA；α3神经型尼古丁受体；神经母细胞瘤细胞；淀粉样蛋白前体蛋白10【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofinhibitedgeneexpressionofα3nicotinicacetylcholinereceptor(nAChR)inducedbyRNAinterferenceonthemetabolismof(amyloidprecursorpeptide(APP).MethodsThesiRNAcodingoligonucleotidesequencestargetin

4、gα3nAChRweredesignedandsynthesized.TheannealedproductwasclonedintopSliencer3.1H1neovector.Therecombinantα3nAChRpSilencer3.1H1neovectorwastransfectedintotheSHSY5Ycells.ThestablecloneswerescreenedbyG418medium,andthelevelsofα3nAChRmRNAandproteinweremonitoredbyusingRealti

5、mePCRandWesternblottingrespectively.Thelevelsofthe(formofsecretedAPP((APPs)andtotalAPPwerealsodeterminedbyWesternblotting.ResultsComparedwithcontrol,theexpressionlevelsofmRNAandproteinintheSHSY5Ycellstransfectedwiththerecombinantα3nAChRpSilencer3.1H1neovectorweredecrea

6、sedbytheinhibitoryefficiencywith98%and66%respectively.TheproteinleveloftheαAPPswasreducedandnosignificantchangeoftotalAPPwasobserved.ConclusionsTheinhibitedgeneexpressionofα3nAChRresultedfromtherecombinantα3nAChRsiRNAcandecreasecleavageofAPPby(secretase,whichsuggestthatα

7、3nAChRmayplayasignificantneuroprotectiveroleinthepathogenesisof10Alzheimer′sdisease.【Keywords】SilenceinterferenceRNA;α3nAChR;Neuroblastomacell;Amyloidprecursorpeptide神经型尼古丁受体（nAChR）与大脑学习记忆、智力发育和识别能力等脑功能有关，还具有明显的神经保护作用〔1～3〕。研究表明，尼古丁受体与淀粉样前体蛋白(APP)的代谢过程有密切联系，在阿尔茨海默病(AD)的发病中

8、起着重要的作用〔2〕。小干扰RNA(siRNA)能特异性结合并切割同源性mRNA，是转录后基因沉默现象的重要机制之一〔4〕。运用siRNA真核表达载体在哺乳动物细胞内合成siRNA能高效抑制特