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时间:2018-08-01
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1、SHSY5Y神经细胞中尼古丁受体α3亚单位基因表达抑制与APP代谢的关系作者:唐智安宇齐晓岚肖雁单可人官志忠【摘要】目的用RNA干扰技术抑制神经型尼古丁受体(nAChR)α3亚单位基因表达并观察对神经细胞淀粉样蛋白前体蛋白(APP)代谢的影响。方法设计并体外合成α3nAChR的特异性编码siRNA序列的寡核苷酸,退火后克隆至pSliencer3.1H1neo质粒中,构建重组质粒α3nAChRpSilencer3.1H1neo。将α3nAChRpSilencer3.1H1neo转染SHSY5Y细胞,用含G418的培养液筛选,挑选阳
2、性克隆后采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测转染细胞中α3nAChRmRNA及蛋白表达水平的变化;并测定分泌型APP、总APP蛋白表达的变化。结果成功构建α3nAChRsiRNA表达质粒,转染后经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞克隆株,与对照组相比,α3nAChRmRNA及蛋白表达量均降低(抑制率分别为98%和66%);分泌型APP表达下降,总APP水平比较表达水平无显著性差异。结论α3nAChRsiRNA表达质粒能特异性抑制α3nAChR基因表达,α3nAChR可能通过增加α分泌酶对APP的切割发挥神经保护作用。【关键词】
3、siRNA;α3神经型尼古丁受体;神经母细胞瘤细胞;淀粉样蛋白前体蛋白10【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofinhibitedgeneexpressionofα3nicotinicacetylcholinereceptor(nAChR)inducedbyRNAinterferenceonthemetabolismof(amyloidprecursorpeptide(APP).MethodsThesiRNAcodingoligonucleotidesequencestargetin
4、gα3nAChRweredesignedandsynthesized.TheannealedproductwasclonedintopSliencer3.1H1neovector.Therecombinantα3nAChRpSilencer3.1H1neovectorwastransfectedintotheSHSY5Ycells.ThestablecloneswerescreenedbyG418medium,andthelevelsofα3nAChRmRNAandproteinweremonitoredbyusingRealti
5、mePCRandWesternblottingrespectively.Thelevelsofthe(formofsecretedAPP((APPs)andtotalAPPwerealsodeterminedbyWesternblotting.ResultsComparedwithcontrol,theexpressionlevelsofmRNAandproteinintheSHSY5Ycellstransfectedwiththerecombinantα3nAChRpSilencer3.1H1neovectorweredecrea
6、sedbytheinhibitoryefficiencywith98%and66%respectively.TheproteinleveloftheαAPPswasreducedandnosignificantchangeoftotalAPPwasobserved.ConclusionsTheinhibitedgeneexpressionofα3nAChRresultedfromtherecombinantα3nAChRsiRNAcandecreasecleavageofAPPby(secretase,whichsuggestthatα
7、3nAChRmayplayasignificantneuroprotectiveroleinthepathogenesisof10Alzheimer′sdisease.【Keywords】SilenceinterferenceRNA;α3nAChR;Neuroblastomacell;Amyloidprecursorpeptide神经型尼古丁受体(nAChR)与大脑学习记忆、智力发育和识别能力等脑功能有关,还具有明显的神经保护作用〔1~3〕。研究表明,尼古丁受体与淀粉样前体蛋白(APP)的代谢过程有密切联系,在阿尔茨海默病(AD)的发病中
8、起着重要的作用〔2〕。小干扰RNA(siRNA)能特异性结合并切割同源性mRNA,是转录后基因沉默现象的重要机制之一〔4〕。运用siRNA真核表达载体在哺乳动物细胞内合成siRNA能高效抑制特
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