shsy5y神经细胞中尼古丁受体α3亚单位基因表达抑制与app代谢的关系

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1、SHSY5Y神经细胞中尼古丁受体α3亚单位基因表达抑制与APP代谢的关系作者：唐智安宇齐晓岚肖雁单可人官志忠【摘要】目的用RNA干扰技术抑制神经型尼古丁受体(nAChR)α3亚单位基因表达并观察对神经细胞淀粉样蛋白前体蛋白（APP）代谢的影响。方法设计并体外合成α3nAChR的特异性编码siRNA序列的寡核苷酸，退火后克隆至pSliencer3.1H1neo质粒中，构建重组质粒α3nAChRpSilencer3.1H1neo。将α3nAChRpSilencer3.1H1neo转染SHSY5Y细胞，

2、用含G418的培养液筛选，挑选阳性克隆后采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测转染细胞中α3nAChRmRNA及蛋白表达水平的变化；并测定分泌型APP、总APP蛋白表达的变化。结果成功构建α3nAChRsiRNA表达质粒，转染后经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞克隆株，与对照组相比，α3nAChRmRNA及蛋白表达量均降低（抑制率分别为98%和66%）；分泌型APP表达下降，总APP水平比较表达水平无显著性差异。结论α3nAChRsiRNA表达质粒能特异性抑制α3nAChR基因表达，α3nAChR

3、可能通过增加α分泌酶对APP的切割发挥神经保护作用。【关键词】siRNA；α3神经型尼古丁受体；神经母细胞瘤细胞；淀粉样蛋白前体蛋白【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofinhibitedgeneexpressionofα3nicotinicacetylcholinereceptor(nAChR)inducedbyRNAinterferenceonthemetabolismof(amyloidprecursorpeptide(APP).Methods

4、ThesiRNAcodingoligonucleotidesequencestargetingα3nAChRedium,andthelevelsofα3nAChRmRNAandprotEinonitoredbyusingRealtimePCRandEM培养液购自GibcoIntrovagen公司（英国）；普通化学试剂均购自Sigma公司；源于人脑的神经母细胞瘤细胞株(SHSY5Y细胞）购于GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures公司（德国）；羊抗3、

5、鼠抗β肌动蛋白（βactin）多克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗羊及抗鼠二抗购自SantaCruz公司(美国)；Lipofectamine2000购于Invitrogen公司(美国)；pSilencerTM3.1H1neo质粒和阴性对照siRNA购自Ambion公司(美国)；E.Z.N.AENDOfreeplasmidMiniKit购于Omega公司。　　1.2siRNA的设计、合成　　根据GenEbank提供的α3nAChR（NM_000743.2）、siRNA设计原则和BLAST同源分

6、析，利用Ambion公司提供的在线软件（techlib/misc/siRNA_finder.html）设计针对α3nAChR基因编码区（460～480bp）的寡核苷酸模板序列：正义链5′GATCCGTGACTACAAGCTGAAGTGGTTCAAGAGACCACTTCAGCTTGTAGTCATTTTTTGGAAA3′；反义链5′AGCTTTTCCAAAAAATGACTACAAGCTGAAGTGGTCTCTTGAACCACTTCAGCTTGTAGTCACG3′；(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成

7、)。此互补序列为两条反向重复序列，两端分别带有HindⅢ和BamHⅠ的酶切位点，中间为9个连续碱基TTCAAGAGA分隔的反相重复靶序列，并以6个T做为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。　　1.3表达质粒的构建、转化及鉴定　　根据Ambion公司pSilencerTMneo试剂说明操作。将模板链退火连接，用T4DNA连接酶将其定向克隆至线性化质粒pSilencerTM3.1H1neoH1启动子之后，构建成重组体质粒。将重组体质粒转化DH5α大肠杆菌,挑选单克隆菌落培养扩增。用质粒提取试剂盒抽提细菌质粒DNA，质

8、粒DNA酶切、电泳鉴定插入片段大小，测序鉴定插入碱基序列和方向。　　1.4细胞培养和转染　　SHSY5Y细胞常规培养，培养基为DMEM，加入15%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，于37℃、5%CO2培养箱培养。生长良好的细胞于转染前1d传代于6孔板，细胞融合率达80%～90%时采用脂质体Lipofectamine2000进行转染，按转染试剂盒说明书进行操作。设空白对照组、阴性对照siRN