人参水提物对β淀粉样蛋白诱导shsy5y细胞凋亡的保护作用

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1、人参水提物对β淀粉样蛋白诱导SHSY5Y细胞凋亡的保护作用胡胜全余惠旻刘塔斯杨大坚陈新滋何翠君【摘要】　　目的研究人参水提物（ol/L诱导SHSY5Y细胞72h后，镜下观察到细胞变圆，损伤并聚集，Hoechst33258染色可见明显的颗粒状和固缩状荧光，流式细胞仪检测到明显的亚二倍体峰，凋亡率达(37.30±0.69)%。而Aβ25-35和不同浓度的TT值显著高于Aβ25-35处理组（P0.01），流式细胞仪检测凋亡率分别降低到(14.70±3.18)%，(7.23±1.51)%，(6.14±0.40)%，(5.88±1.33)%，呈现剂量依赖关系。结论人参水提物对Aβ253

2、5诱导的SHSY5Y细胞凋亡有显著的保护作用。【关键词】SHSY5Y细胞；Aβ2535；人参水提物；细胞凋亡　　　Abstract：ObjectiveTostudytheneuroprotectiveeffectsofyloidβpeptide.MethodsSH-SY5YcellseasuredbyMTTtest,themorphologyofSHSY5Ycellsol/L72hlater,SHSY5Ycellsturnedrounder,aggregatedandeHoechst33258.Cellsdisplayedatypicalsubdiploidpeakin

3、floetry,andthepercentageofapoptosisol/Landdifferentconcentrations(1，5，10，15mg·ml-1)ofdosedependentlydeclinedto(14.70±3.18)%,(7.23±1.51)%,(6.14±0.40)%and(5.88±1.33)%respectively(P0.05).ConclusionTT(Sigma公司)；DMSO(Sigma公司)；Hoechst33258(Fluka)；PI(Sigma公司)；RNase(sigma公司)；人参(深圳华辉药业有限公司，产地吉林，经湖南中医药大

4、学药学院刘塔斯教授鉴定为人参)。　　1.2仪器CO2培养箱，美国Shellab；倒置荧光相差显微镜，德国Leica公司(型号：DC300)；超净工作台，ESCO公司；离心机，德国Hettich公司(型号：Rotofix32)；低温离心机，美国Coulter公司(型号：AllegraTM21R)；流式细胞仪，美国Coulter公司(型号：EpicsXL)；酶标仪，德国BMG公司(型号：PolarstarGalaxy)。　　1.3药物制备　　1.3.1人参水提物取100g人参粉碎，加8倍蒸馏水浸泡30min，水浴2h，纱布过滤，滤渣先后加6倍，4倍量水，各提30min。3次滤液合并，冷

5、冻干燥，得到40g冻干粉，得率40%。冻干粉溶于灭菌去离子水，12000g，离心5min，上清液过0.22μm的滤膜，培养基稀释成实验所需浓度(以生药浓度计)。　　1.3.2Aβ25-351mgAβ25-35溶于943μl灭菌去离子水，配制1mmol/L的母液，-20℃保存，用前37℃老化7d，培养基稀释成实验所需浓度。　　1.4细胞培养及预处理SH-SY5Y细胞取自本实验室细胞库。用含有体积分数为10%的FBS，1%的NEAA（非必需氨基酸）的1640完全培养基，于37℃，5%的CO2孵箱中培养。4d进行1次传代，传代按1∶3进行。取生长期细胞进行实验。　　1.5实验分组将细胞分

6、3组。正常对照组：常规加入完全培养基；Aβ25-35模型组：加入Aβ25-35；TT测定细胞存活率取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×104cells/ml，以100μl/g/ml的MTT(PBS配)10μl，4h后，弃培养液，加DMSO150μl/孔，轻轻振荡10min，使甲臜颗粒溶解，用酶标仪在570nm处读取吸光度(OD)值，取6孔均值按下列公式计算，细胞存活率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。　　1.6.3Hoechst33258染色形态学观察将SH-SY5Y细胞（7×104/ml）接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按要求给予不同的处理因素后，加入新鲜配制的4％

7、多聚甲醛（pH为7.4）于37℃固定细胞30min，PBS液洗两次，加5mg/LHochest33258染色液染色30min，PBS液洗后，用封片液（20mmol/L柠檬酸，50mmol/L磷酸氢二钠，50％甘油，pH5.5）封片后荧光显微镜观察、摄片。　　1.6.4PI单染流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期调整细胞密度为7×104cells/ml，以1.5ml/in离心10min，去上清，PBS漂洗两次，沉淀中缓慢依次加入70％的冰乙醇固定。-20℃固定24h。固定