db22t 2394-2015 猪诱导多潜能干细胞（ipscs）的制备和鉴定

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1、ICS65.020.30B43备案号：48409-2016DB22吉林省地方标准DB22/T2394—2015猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的制备和鉴定Regulationofpreparationandidentificationofinducedpluripotentstemcellsfrompigs2015-12-15发布2016-01-25实施吉林省质量技术监督局发布DB22/T2394—2015前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由吉林省标准研究院提出。本标准由吉林省畜牧业管理局归口。本标准起草单位：吉林省标准研究院。本标准主要起草人：赵慧明、张学明

2、、李子义、唐博、崔娜娜、王琪、杨磊。IDB22/T2394—2015猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的制备和鉴定1范围本标准规定了源于猪胎儿成纤维细胞的猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的工作区条件、主要仪器设备、清洗与消毒、试剂及液体配制、猪iPSCs的制备、警示、标签及其他要求。本标准适用于猪iPSCs在畜牧业生产实践、基础医学研究和临床医疗等方面的应用。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T155

3、62.2环境保护图形标志固体废物贮存（处置）场GB/T24863畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程HG/T3935哺乳类动物细胞培养基NY/T1900畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范SN/T2330化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1诱导多潜能干细胞inducedpluripotentstemcells(iPSCs)通过转染特定的转录因子（如经典的胚胎特异性转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4组合），从已分化体细胞（如成纤维细胞）重编程而获得的多潜能干细胞。3.2猪胎儿成纤维细胞porcinefetalfibroblast(

4、PFF)从妊娠25-30天猪胎儿中，去头、尾、四肢、骨骼、内脏后，消化分离获得的有良好增殖能力的细胞。3.3饲养层细胞feederlayercell将动物胎儿成纤维细胞经丝裂霉素C处理后，失去分裂增殖能力的活细胞。3.4拟胚体embryoidbody釆用悬滴法培养，将干细胞或iPSCs克隆消化成单细胞，检测其体外发育分化能力的方法。3.5畸胎瘤teratoma1DB22/T2394—2015采用皮下注射法，将干细胞或iPSCs注射到免疫缺陷鼠皮下组织中，在SPF级条件下饲养，被注射细胞在体内形成的含三胚层组织结构的瘤体组织。4工作区条件4.1工作区域一般由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保

5、存室、SPF实验动物饲养设施等组成，内部设备条件按照GB/T24863和SN/T2330执行。234.2缓冲间应不小于3m，并设有更衣柜和紫外灯；紫外灯的强度≥1.5W/m，紫外灯管距地面不应超过2.5m，每次照射时间30min以上。4.3无菌室的最低标准应达到万级，并配备通风设备。5主要仪器、设备超净工作台、生物安全柜、冰箱、液氮生物容器、离心机、CO2培养箱、纯水装置、高压蒸汽灭菌器、电子天平、倒置显微镜、荧光显微镜、PCR仪、荧光定量PCR仪、-80℃超低温冰箱。6清洗与消毒所用玻璃器皿和金属器材的清洗与消毒按照GB/T24863执行。7试剂及液体配制各种使用液均用去离子水配制，

6、充分溶解，立即用0.22μm滤膜滤过除菌，除特殊说明，均分装贮存于-20℃下备用，并执行GB/T24863和NY/T1900。包括：水、DMEM(dulbecco'smodifiedeaglemedium)培养基、青-链霉素、无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶-EDTA、冻存液、丝裂霉素C、LB培养基、293细胞培养基、转染培养基、Opti-MEM、ES培养基、条件性培养液、IV型胶原酶（见附录A.1～A.14）。8猪iPSCs的制备8.1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备将见栓12.5d的SPF级（无特定病原体）ICR品系孕鼠用脱颈法处死，分离、培养胎儿成纤维细胞，原代细胞生长至约90

7、%密度时进行传代、丝裂霉素C处理、清洗、消化、计数、冻存。（具体步骤见附录A.15）。8.2猪胎儿成纤维细胞制备8.2.1取材无菌手术取出妊娠25d～30d的猪子宫，两端扎紧后运回实验室，将子宫整个浸泡于75%的酒精中消毒30s，将消毒后的子宫送入细胞培养室中，剪开子宫，取出羊膜完整的胎儿置于75%的酒精中浸泡30s，取出用PBS洗3次后移入生物安全柜中。用剪刀将胎儿去除头、尾、四肢、内脏、脊椎骨及肋骨，用PBS冲洗剩余组织，将组织剪碎至组织块