02细胞生物学研究方法

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1、第二章细胞生物学技术进行初步观察形成可验证的假说设计对照试验收集资料解释结果作出合理结论查阅已有知识细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法定量细胞化学分析细胞培养、细胞质工程与显微操作技术第一节细胞形态结构的观察方法光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。FigureThesizesofcellsandoftheircomponentparts,andtheunitsinwhichtheyaremeasured.图示细胞与其组成部分的大小及测量单位。原子分子细胞器细胞肉眼能分辨的最小值光学显微镜能分辨的最小值电子显微镜能分辨的最

2、小值1.构成：照明系统光学放大系统镜架及样品调节系统2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。（一）普通复式光学显微镜一、光学显微镜TheLightMicroscopy(LM)LightPathwayofMicroscope3.分辨率（resolution）：能够将视野中两个邻近点区分为两个不同实体的能力。光学显微镜的分辨率其中λ为入射光线波长；N：介质折射率；α=镜口角（标本在光轴上的一点对物镜镜口的张角）。表1几种介质的折射率显微镜的几个光学特点：介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好。sinα/2的最大值小于1；油镜介质为香柏油，镜口率可接近1.

3、5。普通光线的波长为400~700nm，光镜的最大分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。光镜样本制作取材：固定：用甲醛或乙醇包埋：石蜡切片：5um染色：不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附观察（二）荧光显微镜Fluorescencemicroscope特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。（三）激光共聚焦扫描显微境Laserc

4、onfocalscanningmicroscope（LCSM）用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。laserconfocalscanningmicroscope,LCSM激光共聚焦扫描显微镜光路图LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)http://www.itg.uiuc.edu/（四）暗视野显微镜darkfieldmicrosco

5、pe聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野背景是黑的，物体边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。环状光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间。相差板（annularphaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。（五）相差显微镜phase-contrastmicros

6、cope原理用途：观察未经染色的玻片标本（六）偏光显微镜polarizingmicroscope用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。载物台是可以旋转。淀粉（七）微分干涉显微镜Differentialinterferencemicroscope1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。Acomparisonofyeastcell

7、sthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC（八）倒置显微镜inversemicroscope物镜与照明系统颠倒；用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。（九）当代显微镜的发展趋势采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。二、电子显微镜TheElectronMicroscope(EM)1.原理以电子束作光源，电磁场作透镜。

8、电子束波长与加速电压(通常50~120