02细胞生物学第二章-细胞生物学研究方法

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1、第二章细胞生物学研究方法本章内容提要•第一节显微技术•一、光学显微镜•二、电子显微镜•三、显微操作技术•第二节生物化学与分子生物学技术•第三节细胞分离技术•第四节细胞培养与细胞杂交第一节显微技术•光学显微镜：-以可见光（或紫外线）为光源。•电子显微镜：-以电子束为光源。透射电镜—、光学显微镜（一）普通光学显微镜•1.构成：•①照明系统•②光学放大系统•③机械装置•2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。透镜的像差•球面像差•慧形像差•像散•像场弯曲•畸变•色差球差：由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，若原光束不

2、同孔径角的各光线，不能交于主轴上的同一位置，以至在主轴上的理想像平面处，形成一弥散光斑（俗称模糊圈），则此光学系统的成像误差称为球差。慧差：由位于主轴外的某一轴外物点，向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，若在理想像平面处不能结成清晰点，而是结成拖着明亮尾巴的慧星形光斑，则此光学系统的成像误差称为慧差。像散：由位于主轴外的某一轴外物点，向光学系统发出的斜射单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，不能结成一个清晰像点，而只能结成一弥散光斑，则此光学系统的成像误差称为像散。场曲：垂于主轴的平面物体经光学系统所成的清晰影像，若不在一垂直于主轴的像平面

3、内，而在以主轴为对称的弯曲表面上，即最佳像面为一曲面，则此光学系统的成像误差称为场曲。畸变：被摄物平面内的主轴外直线，经光学系统成像后变为曲线，则此光学系统的成像误差称为畸变。色差：由白色物点向光学系统发出一束白光，经该光学系列折射后，组成该束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各色光，不能会聚于同一点，即白色物点不能结成白色像点，而结成一彩色像斑的成像误差，称为色差。•3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。•R=0.61λ/N．A．-其中λ为入射光线波长；-N．A．为镜口率(数值孔径)＝ｎsinα/2，-n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）

4、。•思考：如何提高显微镜的分辨能力？角孔径越大，进入物镜的光越多；介质的折射率越大，则数值孔径越大，这些都可以使分辨率提高-NA越大，分辨率越高，或者波长越短，分辨率越高。表一、几种介质的折射率介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66•显微镜的几个光学特点：•制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。•sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。•分辨极限(limitresolution)•放大率(magnification

5、)-总放大率=物镜放大率×目镜放大率-普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。（二）荧光显微镜•工作原理：利用紫外线发生装置(如汞)发出强烈的紫外线光源，通过显微固定的切片或活染的细胞。•特点：光源为紫外线，波长较短，显微镜有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。激发滤板•紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。•紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～45

6、0nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。•紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过。常用型号为QB24（BG12）。•最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板（如B-7）激发。压制滤板（阻断滤板）•压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围的荧光。与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板：1紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6K460。2紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤长的荧光（绿到红），能与BG-12组合。通常用

7、OG-4K510或OG-1K530。3紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的荧光（蓝到红），可与BG-3组合，常用OG-11K470AK490，K510。用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。（三）激光共聚焦扫描显微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM•用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。•能显示细胞样品的立体结构。•分辨力是普通光学显微镜的3倍。•用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。laserconfocalscanningmicroscope,LCSMCon

8、focalmicroscopyisprimarilymono-chromati