03细胞生物学研究方法

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1、第三章细胞生物学研究方法METHODSANDTECHNIQUES本章内容提要第一节显微技术一、光学显微镜二、电子显微镜三、显微操作技术第二节生物化学与分子生物学技术第三节细胞分离技术第四节细胞培养与细胞杂交第一节显微技术光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。—、光学显微镜1.构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。（一）普通光学显微镜3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。D=0.61λ/N*A其中λ为入射光线波长；A为镜口率＝sinα/2，N介质折射率；α=镜口角（样品

2、对物镜镜口的张角）思考：如何提高显微镜的分辨能力？表一、几种介质的折射率显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大设计倍数为1000X。（二）荧光显微镜Fluorescencemicroscope特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；

3、照明方式通常为落射式。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。（三）激光共聚焦扫描显微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。laserconfocalscanningmicroscope,LCSMLCSMImageo

4、faXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)http://www.itg.uiuc.edu/（四）暗视野显微镜darkfieldmicroscope聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两

5、个特殊之处。环形光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间。相位板（annularphaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。（五）相差显微镜原理用途：观察未经染色的玻片标本（六）偏光显微镜polarizingmicroscope用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。载物台是可以旋转。淀粉（七）微分干涉差显微镜Differentialinterferencecont

6、rastmicroscope（DIC）1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。（八）倒置显微镜inversemicroscope物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。（九）当代显微镜的发展趋势采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。二、电子显微镜（一）透射电子显微镜transmissionelectronmicro

7、scope,TEM以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2µm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopicstructures）。1.原理透射电子显微镜TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM表二、不同光线的波长2、制样技术1）超薄切片电子束穿透力很弱，用于电

8、镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。