细胞生物学_03 细胞生物学研究方法讲解材料课件

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1、细胞生物学第三章细胞生物学研究方法生命科学学院主讲李桂兰首先我们学习第一节细胞的形态观察技术第三节细胞工程技术目录主要内容第二节细胞组分的分析与检测技术显微镜技术第一节细胞的形态观察技术µm(10-6m)nm(10-9m)Å(10-10m)肉眼分辨率:0.2mm光学显微镜:0.2µm电子显微镜:0.2nm显微镜技术光学显微镜技术电子显微镜技术SEM（scanningelectronmicroscope）TEM（transmitionelectronmicroscope）扫描隧道显微镜第一节细胞的

2、形态观察技术一、光学显微镜技术以可见光（或紫外光）为光源类型普通复式光学显微镜特殊光学显微镜：相差和微分干涉显微镜、录像增差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜等多功能显微镜激光扫描共焦显微镜第一节细胞的形态观察技术1、普通复式光学显微镜构成：性能参数：分辨率放大率特点和局限性第一节细胞的形态观察技术（1）普通复式光学显微镜性能参数分辨率：区分开两点间的最小距离R=0.61λ/nsin(α/2)NA=nsin(α/2)NA(numericalaperture)为物镜的数值孔径值影响分辨率

3、的因素入射光的波长镜口角介质的折射率第一节细胞的形态观察技术（1）活细胞观察技术—相差显微镜原理：把透过标本的可见光的光程差（相位差）变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。特殊构造：相差物镜、环形光阑、合轴调中望远镜、绿色滤光片第一节细胞的形态观察技术相差显微镜的应用特点：可以对无色透明的标本进行观察。适合于观察未经染色的活细胞。第一节细胞的形态观察技术（2）活细胞观察技术—微分干涉显微镜特点：以平面偏振光为光源，能区分样品厚度的微小差别，增加样品反差，有立体感。应用

4、：观察未染色标本，更适于研究活细胞中较大的细胞器（3）录像增差显微镜—计算机辅助的微分干涉显微镜降低背景噪声，提高分辨率，填补光镜与电镜之间的空白第一节细胞的形态观察技术（4）活细胞观察技术—倒置显微镜应用：通常具有相差物镜，用来观察正在培养的活细胞第一节细胞的形态观察技术3、特殊光学显微镜—荧光显微镜光源：汞灯—短波长紫外光装置：激发滤光片、阻断滤光片、分色镜荧光染料染色应用：在光镜水平对细胞中特异的蛋白质分子或核苷酸片段等进行定位、定性分析。绿色荧光蛋白（greenfluorescentpr

5、otein，GFP）第一节细胞的形态观察技术3、特殊光学显微镜—荧光显微镜第一节细胞的形态观察技术Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen4、光学显微镜—激光扫描共焦显微镜用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描，排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，可自动改变观察的焦平面,通过“光学切片”观察较厚样品的内部结构，并可通过三维重构,形成立体图像。在研

6、究亚细胞结构与组分方面应用广泛.第一节细胞的形态观察技术4、光学显微镜—激光扫描共焦显微镜第一节细胞的形态观察技术光学显微镜—激光扫描共焦显微镜第一节细胞的形态观察技术FigureComparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentp

7、robeforactinfilaments.Theconventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresenceoffluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.Intheconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembryo.1荧光共振

8、能量转移技术5、与荧光观察有关的技术第一节细胞的形态观察技术2荧光漂白恢复技术检测活体中生物大分子纳米级距离和距离变化的工具。GFP突变体：CFP青绿色、YFP黄色检测活体细胞表面或内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率大小的技术。6、特殊显微镜—暗视野显微镜原理：通过在明场显微镜上安装暗场聚光镜，使来自聚光镜的光线不直接入射到物镜内，而被标本散射的光则可以进入物镜，从而达到在黑暗的背景下可看到标本的外部形态。特点视野是暗的，物象是亮的。可以观察在明视场中看不见的细菌等微小标本的存在。只能