细胞生物学研究方法专题讲座讲解材料课件

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1、第三章细胞生物学研究方法STUDYMETHODSOFCELLBIOLOGY本章内容提要细胞生物学研究方法多种多样,总的说来,可分为四个大类:显微技术细胞组分分析与原位检测技术细胞培养与细胞工程分子生物学技术第一节细胞形态结构的观察方法显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同可分为:光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源显微镜的发明打开了微观世界的大门光学显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜—、光学显微技术普通复式光学显微镜荧光显微镜激光共聚焦扫描显微镜暗视野显

2、微镜相差和微分干涉显微镜倒置显微镜1.显微镜的发明300多年前Leeuwenhoek世界上最早的显微镜RobertHooke软木　蜂窝状的小格子“细胞”（一）普通光学显微镜Lightmicroscopy2.光学显微镜构成：①照明系统:②光学放大系统:③机械装置:镜座.镜柱等目镜与物镜(玻璃透镜)光学显微镜光源、折光镜、聚光镜经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。4.分辨力：D=0.61λ/N．A．其中λ为入射光线波长；N．A＝ｎsin(α/2)，为镜口率,n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。

3、指分辨物体最小间隔的能力.是显微镜的最重要参数.如何提高显微镜的分辨能力？显微镜的物像是否清楚主要决定了哪些因素？增加分辨率的二个必备条件:增大镜口率---有一定限度缩短波长---为可靠办法普通光镜的最大分辨率为0.2μm,大于0.2μm的结构为显微结构,而小于0.2μm的称为亚显微结构.几种介质的折射率为什么使用油镜能提高分辨率?不同光线的波长光学显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.

4、05~0.95；其中低倍镜0.28，高倍镜0.65，油镜1.25，油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此光学显微镜的最大设计倍数为1000X。.普通光镜样品的制作:取材－固定－脱水－包埋－切片－脱蜡－复水－染色－脱水－透明－封片－观察固定剂(甲醛)固定：杀死细胞，稳定细胞的化学成份；包埋剂(石蜡)包埋;切片(5μm)；染色:如苏木精对负电荷分子有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料如伊红可使细胞质染色；苏丹染

5、料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。紫外线发生装置(如弧光灯、水银灯等)什么是荧光?特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜(0.1μm)；有两个特殊的滤光片；可观察活细胞.物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。荧光显微镜的光通路荧光显微镜的特殊用途:用于观察能激发出荧光的结构免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断细胞与组织中物质的吸收与运输化学物质的分布与定位等荧光现象有两种:自发荧光（叶绿素）诱发荧光（加荧光素）微管呈绿色、微丝红色、核

6、蓝色Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen物镜与聚光镜同时聚焦到同一个小点。用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。一束光线通过聚焦成点，在样品表面扫描后成象。它是一个扫描光学显微镜，因为在一个时间试样上只有一个点被照亮。随着试样被扫描，像素的积累便构成了图像。因为物镜的焦平面很薄（只有0.5皮米）所以能够获得试样的真正光学断面。所有在焦平面以上或以下的图像数据都到不了探测器。随着焦平面的上升或者下降（Z轴），可以得到试样

7、的分层图像并存储起来，这些分层图像就由计算机重构成三维图像。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像,研究亚细胞结构与组分。共聚焦?laserconfocalscanningmicroscope,LCSMLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)（四）暗视野显微镜darkfieldmicroscope聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射

8、和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。用以观察未经染色的活体或胶体粒子暗视野显微镜光路把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，明者更明，暗者更暗，立体感增强。从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜的特殊之处:物镜中加了涂有氟化镁的相位板