3-3’二吲哚甲烷对放射性...损伤的防护作用及其机制研究_杨百霞

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·554·交通医学2022年第36卷第6期MedJofCommunications,2022,Vol.36,No.6［文章编号］1006-2440（2022）06-0554-04［引文格式］杨百霞，谢国栋，倪峰，等.3-3’二吲哚甲烷对放射性肺损伤的防护作用及其机制研究［J］.交通医学，2022，36（6）：554-557.3-3’二吲哚甲烷对放射性肺损伤的防护作用及其机制研究*杨百霞**，谢国栋，倪峰，崔晓佳，葛琴（南通大学附属肿瘤医院/南通市肿瘤医院放疗科，江苏226361）[摘要]目的：探讨3-3’二吲哚甲烷（DIM）对小鼠放射性肺损伤的防护作用及其作用机制。方法：120只雌性C57BL/6小鼠，随机分为空白对照组、单纯照射组（一次性全胸照射16Gy）、单纯DIM组（仅灌胃DIM75mg/kg）、照射+DIM组（照射前30min灌胃DIM75mg/kg）、照射+泼尼松组（照射前30min灌胃泼尼松5mg/kg）。于照射后24小时、1周、2周、4周处死小鼠，取小鼠肺组织标本切片，HE染色后显微镜下进行病理学评分，Westernblot检测肺组织TGF-β1、VEGF蛋白表达。结果：与单纯照射组比较，照射+DIM组小鼠肺损伤程度明显减轻，肺组织TGF-β1及VEGF蛋白表达水平明显降低。结论：3-3’二吲哚甲烷对小鼠放射性肺损伤有明显的辐射防护作用，其机制可能与TGF-β1/VEGF通路有关。[关键词]3-3’二吲哚甲烷；放射性肺损伤；辐射防护；TGF-β1/VEGF通路[中图分类号]R730.55[文献标志码]A[DOI]10.19767/j.cnki.32-1412.2022.06.002Studyontheprotectiveeffectandmechanismof3-3’diindolylmethaneonradiation-inducedlunginjuryYANGBaixia,XIEGuodong,NIFeng,CUIXiaojia，GEQin(DepartmentofRadiotherapy,AffiliatedTumorHospitalofNantongUniversity/NantongTumorHospital,Jiangsu226361)[Abstract]Objective:Toinvestigatetheprotectiveeffectandmechanismof3-3’diindolylmethane(DIM)onradia-tion-inducedlunginjuryinmice.Methods:120femaleC57BL/6micewererandomlydividedintoblankgroup,simpleirradiationgroup(16Gyoftotalchestirradiation),simpleDIMgroup(75mg/kgofDIMbygavage),irradiation+DIMgroup(75mg/kgofDIMbygavage30minutesbeforeirradiation)andirradiation+prednisonegroup(5mg/kgofprednisonebygavage30minutesbeforeirradiation).Themicewerekilledat24hours,1week,2weeksand4weeksafterirradiation.Thelungtissuesamplesofthemiceweresectioned.AfterHEstaining,thepathologicalscorewasperformedunderthemicro-scope,TGF-β1andVEGFproteinexpressioninthelungtissuewasdetectedbyWesternblot.Results:Comparedwiththesimpleirradiationgroup,thedegreeoflunginjuryintheirradiation+DIMgroupwassignificantlyreduced,andthelungtis-sueTGF-β1andVEGFproteinexpressionleveldecreasedsignificantly.Conclusion:3-3’diindolemethanehasobviousradiationprotectiveeffectonradiationlunginjuryinmice.ItsmechanismmayberelatedtoTGF-β1/VEGFpathway.[Keywords]3-3’diindolylmethane;radiationlunginjury;radiationprotection;TGF-β1/VEGFpathway放射性肺损伤（radiation-inducedlunginjury，是纵隔淋巴瘤（5%～10%）和乳腺癌（1%～5%）[2]。RILIRILI）是胸部肿瘤放疗最常见的并发症之一，病变周病理变化包括放射性肺炎和放射性肺纤维化两个阶围的肺组织因接受超过阈值的放射剂量，产生不可段，是动态的连续过程[3-4]。目前RILI发生机制尚不逆性损伤[1]。目前精确放疗技术不断改进，大大降低明确，是由多种细胞因子参与，涉及细胞损伤、氧化了辐射剂量和体积，但仍有30%以上患者发生RILI。应激、基因改变等复杂过程。寻找放射性肺损伤的防RILI在肺癌放疗中的发病率最高（5%～25%），其次护药物是临床上亟待解决的问题。*[基金项目]南通市卫生健康委员会科研立项课题（MB2019019）。**[作者简介]杨百霞，女，汉族，陕西西安人，生于1980年12月，硕士研究生，主治医师。研究方向：肿瘤放射治疗学。通信作者：葛琴，E-mail：geqin.kelley@163.com

1交通医学2022年第36卷第6期MedJofCommunications,2022,Vol.36,No.6·555·3-3’二吲哚甲烷（diindolylmethane，DIM）是吲建立成功。哚-3-甲醇（indole-3-carbinol，I3C）衍生物，为小分1.2.2肺组织病理学评分：根据肺组织病变（肺泡壁子化合物，人体口服吸收顺利，耐受性良好，无明显充血、出血、炎细胞浸润及肺气肿）程度评分：基本正毒副作用[5]。I3C及DIM可以正向调节电离辐射导致常为0分，轻微或极少量计0.5分，轻度或少量计1的DNA损伤、修复密切相关蛋白ATM及BRCA1表分，中度或较多计2分，重度或多量计3分，极重度达及其磷酸化[6]。DIM通过ATM/BRCA1磷酸化激或大量计4分。根据病变区域占整个制片区域的比活，选择性增加正常组织耐辐射能力，延长受照动例评分，基本正常计0分，局部病变（＜12%）计0.5物的存活时间，而不影响肿瘤组织的放射治疗敏感分，小范围病变（12%～25%）计1分，中等范围病变性[7]。本研究通过建立放射性肺损伤小鼠模型[8-11]，探（25%～50%）计2分，大范围病变（50%～75%）计3讨DIM对放射性肺损伤的防护作用及其作用机制。分，广泛病变（＞75%）计4分。累加所有分数，取平均分，分值越高提示损伤程度越严重。1材料与方法1.2.3Westernblot检测蛋白表达：取照射后2周的1.1材料与试剂120只清洁级雌性C57BL/6小小鼠肺组织，剪碎，RIPA裂解液提取蛋白，BCA试剂鼠，体重20±2g（无锡江南实验动物中心），自由进食盒进行蛋白定量。用10%SDS-PAGE分离蛋白，转进水，常温下适应性喂养3d后用于实验。DIM（纯移蛋白至PVDF膜。5%BSA室温封闭2h，加入一度＞99%，江苏普乐司生物科技有限公司），EDTA抗抗，4℃封闭过夜。次日洗去一抗（TGF-β1，1∶1000；原修复液、抗转化生长因子-β1（transforminggrowthVEGF，1∶1200），加入二抗室温封闭1h，将膜洗净，factor-β1，TGF-β1）一抗（1∶100，英国Abcam公司），滴加化学发光液，凝胶成像系统获取蛋白条带图片，BSA（Sigma），二抗：HRP标记山羊抗兔（1∶200，KPLImageJ软件对条带灰度值定量分析。公司），抗血管内皮细胞生长因子（vascularendothe－1.3统计学处理应用SPSS19.0统计软件进行lialgrowthfactor，VEGF）一抗（1∶100，SantaCruz公数据处理分析。计量资料以x±s表示，组间差异性比司）；二抗：HRP标记的山羊抗兔鼠（即用型，丹麦较采用One-WayANOVA检验。P＜0.05为差异有统DAKO公司）。Synergy直线加速器（瑞典ELEK-TA计学意义。公司），正置光学显微镜（E100）、成像系统（DS-U3）（日2结果本尼康公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。1.2方法2.1各组小鼠放射性肺损伤病变程度比较照射1.2.1动物模型构建：将120只C57BL/6小鼠随机后各时间点各组病变程度比较，差异均有统计学意分为空白对照组、单纯照射组、单纯DIM组、照射+义（P＜0.05），单纯照射组病变最明显，其次是照射+DIM组、照射+泼尼松组，每组24只。10%水合氯醛泼尼松组，照射+DIM组病变程度最轻，照射后2周麻醉小鼠后，单纯照射组、照射+DIM组、照射+泼尼放射性肺损伤反应最明显。见表1、见图1。松组小鼠采用加速器6MV-X射线单次全胸照射，表1各组小鼠放射性肺损伤评分比较分剂量16Gy。照射+DIM组于照射前30min灌胃照射后照射后照射后照射后组别24h1周2周4周[12]，照射+泼尼松组于照射前30min灌DIM75mg/kg空白对照组3.0±0.93.2±0.23.5±0.33.6±0.1胃泼尼松5mg/kg；单纯DIM组仅灌胃DIM75mg/kg，单纯照射组5.2±1.15.5±0.45.9±0.25.6±0.5空白对照组给予同等容量生理盐水灌胃。小鼠经单单纯DIM组4.3±0.24.4±0.54.2±0.64.3±0.3次16GyX射线全胸照射后无死亡。照射后于24h、照射+DIM组4.7±0.44.9±0.45.1±0.44.8±0.41周、2周、4周颈椎脱臼法处死小鼠，每次每组处死照射+泼尼松组5.0±0.25.2±0.55.4±0.25.4±0.16只小鼠。将肺组织以10%甲醛液固定，常规取P值＜0.01＜0.001＜0.001＜0.001材、石蜡包埋、切片，HE染色，于显微镜下进行观察。与空白对照组小鼠比较，主要表现为肺泡壁充2.2各组肺组织TGF-β1、VEGF蛋白表达水平比血，有炎细胞浸润，与文献报道基本一致，表明模型较单纯照射组小鼠肺组织TGF-β1、VEGF蛋白表

2·556·交通医学2022年第36卷第6期MedJofCommunications,2022,Vol.36,No.6空白对照组单纯照射组单纯DIM组照射+DIM组照射+泼尼松组图1各组小鼠放射性肺损伤肺组织切片观察（照射后2w）达水平高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜RILI的发生发展涉及多种复杂因素，目前普遍0.05）；照射+DIM组小鼠TGF-β1、VEGF蛋白表达认为放射线导致Ⅱ型肺泡上皮细胞和血管内皮细水平低于单纯照射组，差异有统计学意义（P＜0.05）；胞损伤，产生多细胞因子级联反应，引起细胞因子见图2、图3。照射+泼尼松组小鼠TGF-β1、VEGF蛋瀑布效应，激发炎症反应，不断刺激引起肺组织纤维白表达水平低于单纯照射组，差异有统计学意义（P＜化[19-20]。肺组织受到辐射时引起氧化应激反应，产生0.05）。大量活性氧类物质（reactiveoxygenspecies，ROS），TGF-β1ROS诱导血管内皮细胞凋亡，进一步加重肺组织损VEGF伤[21-22]。而受损细胞释放细胞因子和趋化因子，促使GAPDH炎性细胞迁移到受损部位，释放TGF-β1、TGF-α、空单单照照白纯纯射+射+对照DDIL-6等细胞因子。TGF-β1在细胞凋亡过程中发挥IMIM泼照射尼举足轻重的作用[23]，Ⅱ型肺泡上皮细胞通过释放组组组组松组[24-25]，而TGF-β1诱导图2各组肺组织TGF-β1、VEGF蛋白表达水平TGF-β1导致肺纤维化的发生血管内皮生长因子（VEGF）的表达，进而加速肺纤维0.450.40化进程[26-27]。有研究证实，DIM可通过多种机制发挥0.35空白对照组0.30抗肿瘤作用，如调控PI3K/Akt通路增加肿瘤细胞凋0.25单纯照射组亡，通过降低HIF-1抑制血管生成[28-29]。0.20单纯DIM组0.150.10照射+DIM组本研究放射性肺损伤小鼠模型实验结果显示，0.05照射+泼尼松组照射前DIM干预能显著减轻小鼠肺组织损伤，显著0.00TGF-β1VEGF减少放疗诱导的小鼠肺组织TGF-β1和VEGF表图3各组肺组织TGF-β1、VEGF蛋白条带灰度值统计达，提示DIM具有辐射防护作用，可能与抑制TGF-β1/VEGF信号通路有关。DIM有望成为防护放射性3讨论肺损伤的潜在药物，但是其毒副作用、用药剂量及作放射治疗是治疗胸部恶性肿瘤的重要手段之用机制还需进一步研究。一，但RILI的发生限制了放疗剂量和靶区体积[13-14]。[参考文献]有研究显示，重度RILI病死率高达50%[15]，胸部放疗患者有2.3%死于RILI[16]。RILI患者早期无明显临[1]LINGOSTI，RECHTA，VICINIF，etal.Radiationpneu－床表现，通常在晚期严重肺纤维化时才被诊断。目前monitisinbreastcancertreatedwithconservativesurgery临床上对RILI的治疗主要是缓解症状[17-18]，因此预andradiationtherapy［J］.IntJRadiatOncolBiolPhys，1991，21（2）：355-360.防性治疗尤为关键。

3交通医学2022年第36卷第6期MedJofCommunications,2022,Vol.36,No.6·557·[2]HANANIAAN，MAINWARINGW，GHEBREYT，etal.nismsandtreatmentofradiation-inducedpulmonaryfibro－Radiation-inducedlunginjury：assessmentandmanagementsis［J］.TranslOncol，2019，12（1）：162-169.［J］.Chest，2019，156（1）：150-162.[18]牛世英，杨彤，张月英.放射性肺损伤机制及干细胞治疗[3]XUT，ZHANGY，CHANGP，etal.Mesenchymalstemcell-研究进展［J］.国际呼吸杂志，2021，41（11）：871-875.basedtherapyforradiation-inducedlunginjury［J］.Stem[19]GIURANNOL，IENTJ，DERUYSSCHERD，etal.Radia－CellResTher，2018，9（1）：18.tion-inducedlunginjury（RILI）［J］.FrontOncol，2019，9：[4]王绿化，傅小龙，陈明，等.放射性肺损伤的诊断及治疗［J］.877.中华放射肿瘤学杂志，2015，24（1）：4-9.[20]ZHOUJ，WUP，SUNH，etal.Lungtissueextracellular[5]ZHAODY，QUHJ，GUOJM，etal.Protectiveeffectsofmatrix-derivedhydrogelsprotectagainstradiation-inducedmyrtolstandardizedagainstradiation-inducedlunginjurylunginjurybysuppressingepithelial-mesenchymaltransi－［J］.CellPhysiolBiochem.2016，38（2）：619-634.tion［J］.JCellPhysiol，2020，235（3）：2377-2388.[6]杨文健，焦蓉，刘月，等.3，3’-二吲哚甲烷对新生大鼠炎症[21]KUNWARA，HASTONCK.Basallevelsofglutathione损伤心肌细胞的保护作用［J］.医药导报，2019，38（9）：peroxidasecorrelatewithonsetofradiationinducedlung1146-1151.diseaseininbredmousestrains［J］.AmJPhysiolLungCell[7]FANS，MENGQ，XUJ，etal.DIM（3，3’-diindolylmethane）MolPhysiol，2014，307（8）：L597-L604.confersprotectionagainstionizingradiationbyaunique[22]李杰，冉永红，郝玉徽.放射性肺损伤的分子机制及其治mechanism［J］.PNAS，2013，110（46）：18650-18655.疗进展［J］.中华肺部疾病杂志（电子版），2021，14（3）：[8]LUL，SUNC，SUQ，etal.Radiation-inducedlunginjury：390-392.latestmoleculardevelopments，therapeuticapproaches，and[23]YANGS，ZAFARKHANMU，LIUB，etal.Invitroanaly－clinicalguidance［J］.ClinExpMed，2019，19（4）：417-426.sisofTGF-βsignalingmodulationofporcinealveolar[9]GIURANNOL，IENTJ，DERUYSSCHERD，etal.Radia－macrophagesinporcinecircovirustype2binfection［J］.Vettion-inducedlunginjury（RILI）［J］.FrontOncol，2019，9：877.Sci，2022，9（3）：101.[10]欧雪.NF-κB信号通路在大鼠放射性肺损伤中的变化及[24]BALLID，USTIYANV，ZHANGY，etal.Foxm1transcrip－意义［D］.南宁：广西医科大学，2017.tionfactorisrequiredforlungfibrosisandepithelial-to-[11]赵德云.桃金娘油对放射性肺损伤的防治作用及机制研mesenchymaltransition［J］.EMBOJ，2013，32（2）：231-究［D］.上海：第二军医大学，2016.244.[12]董佳丽，路璐，樊赛军.3，3’-二吲哚甲烷对小鼠造血系统[25]LIANGSK，CHAOSY，LICC，etal.Foxm1transcription辐射损伤的保护作用［J］.天津医药，2017，45（6）：580-factorregulateslungadenocarcinomadevelopment［J］.IOP583.ConferenceSeriesEarthandEnvironmentalScience，2019，[13]SPIROSG，DOUSEJ，READC，etal.Complicationsof276：012003.lungcancertreatment［J］.SeminRespirCritCareMed，[26]THOMPSONHG，MIHJD，KRASIEVATB，etal.Epithe－2008，29（3）：302-317.lial-derivedTGF-beta2modulatesbasalandwound-heal－[14]YAMASHITAH，NAKAGAWAK，NAKAMURAN，etal.ingsubepithelialmatrixhomeostasis［J］.AmJPhysiolLungExceptionallyhighincidenceofsymptomaticgrade2-5ra－CellMolPhysiol，2006，291（6）：L1277-L1285.diationpneumonitisafterstereotacticradiationtherapyfor[27]VUJASKOVICZ，GROENHJ.TGF-beta，radiation-in－lungtumors［J］.RadiatOncol，2007，2：21.ducedpulmonaryinjuryandlungcancer［J］.IntJRadiat[15]OHEY.Treatment-relateddeathfromchemotherapyandBiol，2000，76（4）：511-516.thoracicradiotherapyforadvancedcancer［J］.Panminerva[28]AGGARWALBB，ICHIKAWAH.MoleculartargetsandMed，2002，44（3）：205-212.anticancerpotentialofindole-3-carbinolanditsderivatives[16]HERMESA，WASCHKIB，GATZEMEIERU，etal.Charac－［J］.CellCycle，2005，4（9）：1201-1215.teristics，treatmentpatternsandoutcomesofpatientswith[29]BRIGNALLMS.Preventionandtreatmentofcancerwithsmallcelllungcancer-aretrospectivesingleinstitutionindole-3-carbinol［J］.AlternMedRev，2001，6（6）：580-analysis［J］.LungCancer，2011，71（3）：363-366.589.[17]CHENZ，WUZ，NINGW.Advancesinmolecularmecha－[收稿日期]2022-09-09