DB22T 2015-2014 坏死梭杆菌检测PCR法

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1、ICS11.220B41备案号：41809-2014DB22吉林省本标准仅供内部使用不得翻印地方标准DB22/T2015—2014坏死梭杆菌检测PCR法DeterminationofFusobacteriumnecrophorum—PolymeraseChainReaction本标准仅供内部使用不得翻印2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2015—2014本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1—2009、

2、GB/T20001.4—2001给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出，吉林省畜牧业管理局归口。本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：陈立志、冯二凯、王秀东、刘晓颖、姚志利、王峰、王雷、司方方、范琳琳、徐晶、姜英。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2015—2014本标准仅供内部使用不得翻印坏死梭杆菌检测PCR法警告——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实

3、践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题，使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合管家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了坏死梭杆菌的聚合酶链反应（PCR）检测方法。本标准适用于反刍动物坏死梭杆菌的检测和分型。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法WS/T230临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用本标准仅供内部使用不得翻印3术

4、语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1坏死梭杆菌fusobacteriumnecrophorum一种严格厌氧的革兰氏阴性多形态的条件致病杆菌。3.2PCR聚合酶链反应polymerasechainreaction体外酶促合成特异性DNA片段的一种分子生物学实验方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即模板DNA先经高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与两条模板DNA链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）为底物，使退火引

5、物得以延伸。如此反复，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。4缩略语DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleosideaacid）。dNTP:脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosbate）。EDTA:乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）。1DB22/T2015—20145原理针对本标准仅供内部使用不得翻印坏死梭杆菌白细胞毒素两亚种启动子的特异性区域基因序列设计引物，应用聚合酶链反应（PCR）技术从临床疑似坏死杆菌病病料扩增特异

6、性DNA片段，根据是否扩增特异性片断及片断大小对坏死梭杆菌进行检测和分型。6试剂与材料除非另有说明，所有的化学试剂均为分析纯。实验用水规格应符合GB/T6682中二级水的规定6.1试剂6.1.1引物上游引物：P1:5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3上游引物：P2:5-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3下游引物：P3:5-GCACGACAAACCAAATAGC-3配制成10μmol/L，-20℃保存。6.1.2DNA分子量标准：DL2000。6.1.3细本标准仅供内部使用不得翻印菌基因组DNA提

7、取试剂盒。6.1.4dNTP溶液，含dATP、dTTP、dCTP和dGTP，各2.5mnol/L。6.1.5DNA聚合酶（5U/μL）。6.1.610×PCRbuffer（不含氯化镁）（市售）：100mmol/LKCl,160mmol/L(NH4)2SO4,20mmol/LMgSO4,200mmol/LTris-HCl(pH8.8),1%TritonX-100，1mg/mLBSA。6.1.7氯化镁（MgCl2）25mmol/L。6.1.8琼脂糖，电泳级。1%琼脂糖凝胶的配制：琼脂糖1gTAE电泳缓冲液（50倍）2mL灭

8、菌三蒸水98mL微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液5μL。6.1.9TE缓冲液（1×）：10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA。6.1.10溴化乙锭（10mg/mL）：称量100mg溴化乙锭溶解于10mL水中，然后分装成1mL/份，4℃避光保存。6.1.1150×TAE：称量242.0gTri