脆弱类杆菌荧光定量pcr法检测

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1、脆弱类杆菌荧光定量PCR法检测【关键词】脆弱类杆菌；荧光定量PCR；SYBR,Green,I　　　摘要：目的探讨荧光定量PCR技术检测脆弱类杆菌。方法用特异性引物和荧光染料实时PCR扩增并检测产物。结果脆弱类杆菌标准株(ATCC25285)和4株分离株均有特异扩增曲线，灵敏度达102个菌；而大肠埃希菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌无特异扩增曲线。结论荧光染料实时PCR技术可特异并定量检测脆弱类杆菌　　关键词：脆弱类杆菌；荧光定量PCR；SYBRGreenI　　Detectionbacteriafr

2、agilebySYBRGreenreal-timePCR　　Abstract：ObjectiveToidentifythebacteriafragiles(B.fragiles)by16StargetrRNArealtimePCR.MethodsApairofspecificprimersePCR.ResultsTheB.fragilisATCC25285and4separativestrainsofB.fragilisappearedinthespecialamplificationprodu

3、ctcurve,ophilusdidnot.TheflourescentqantificativePCRcandetect102bacteria.Conclusion16SrRNAtargetedprimerandfluorescentquantifiverealtimePCRcanbeapplicablefortheidentificationandquantificationofB.fragilis.　　Keyp5700,美国Perkin-Elmer公司），离心机；细菌基因组提取试剂盒、Ex

4、TaqDNA聚合酶、10×缓冲液、SYBRPremixExTaqTM（perfectReal-time）荧光染料〔TakaRa宝生物工程（大连）有限公司〕。　　12方法　　121引物设计在16SrRNA序列中第831-864位点和982-1007位点，通过分析软件Blast(ncbinlmnihgov)同GenBank中大肠埃希菌等基因序列相比较，参照　　2结果　　21特异性PCR结果显示，5株脆弱类杆菌均有特异扩增曲线，而大肠埃希菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌无特异扩增曲线。　　22灵敏度（图

5、1）图1可见，荧光信号强度（Rn）维持在基线（0对应的横线）上，15个循环后，Rn开始上升。107，106，105的扩增曲线在30个循环后到平台期，104,103,102的扩增曲线在38～40个循环时到平台期。灵敏度达102个菌。.L.编辑。　　自左向右的扩增曲线为：107,106,105,104,103,102,101μl　　图1不同菌数的脆弱类杆菌标准株荧光定量PCR扩增图（略）　　23融解曲线（图2）图2可见，主峰为特异的扩增产物，从105～10细菌含量的主峰峰值逐个降低，但位置一致；主峰

6、前的小峰（79℃处）,可能是很少量的引物二聚体形成而致,并随细菌含量（模板量）降低，主峰与小峰的峰值差减小。　　自上向下的峰线为105,104,103,102,101μl　　图2扩增产物的融解曲线（略）　　3讨论　　本文结果显示，前引物序列831～864在脆弱类杆菌中完全互补，而与大肠埃希菌等互补序列不多；序列982～1007为脆弱类杆菌特有序列，其他细菌没有与之相对应的序列。荧光定量PCR表明，5株脆弱类杆菌有扩增产物，采用相同引物用rPCR扩增，在预计区域有扩增条带〔3〕，2种方法结果一致，

7、可与大肠埃希菌、乳酸杆菌、嗜热链球相鉴别。本文受检菌菌数可低至102，与其他